白藜蘆醇對小鼠輻射氧化損傷的保護(hù)性研究※

北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所天津市分子和醫(yī)學(xué)重點實驗室（天津300192）

李程程 張 恒 吳紅英 王營營 黃 頌 張珠博 孟愛民▲

白藜蘆醇（Resveratrol，Rev）是一種非黃酮多酚類化合物，化學(xué)名為3’5’4’－三羥基反－二苯代乙烯（3’5’4’－trihydroxy－trans－stilbene），分子量228．24，分子式為C14H12O3，主要來源于蓼科植物虎杖（Polygonumcuspidatum）的根莖提取物，廣泛存在于葡萄、花生等植物中。Rev作為一種多酚類化合物，可以清除羥自由基、過氧化物和氧自由基，其抗氧化損傷主要是通過上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力［1］。對大鼠心肌細(xì)胞和人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的研究表明，Rev可以上調(diào)超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（Catelase）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutamthione peroxidase，GPX）的活力［2，3］，Rev還可以在人靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞中下調(diào)內(nèi)原ROS生成酶NOX4的表達(dá)［2］。因為Rev具有的這些作用，我們進(jìn)一步探討了Rev輻射損傷的防護(hù)作用及其機(jī)制。

材料與方法

1 試劑與設(shè)備 過氧化氫檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號：S0051），Cu／Zn－MnSOD檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品編號：S0105 伽馬射線輻照儀（ExposureInstrument Gammacell－40加拿大 Atomic Energy公司），Rev由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所候琦教授提供，多功能酶標(biāo)儀（Infinite200瑞士Tecan公司），臺式低溫高速離心機(jī)5810R（Eppendorf），ficoll淋巴細(xì)胞分離液（天津美德太平洋有限公司。

2 動物與分組 選取16只C57BL／6小鼠（來源：C57BL／6雄性小鼠SPF級由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，合格證號［SCXK（京）2005－0013］，體重20．0～22．0g，周齡8～12周，隨機(jī)分為對照組（Control），照射組（IR），單獨給藥組（Rev）和照射給藥組（Rev＋I(xiàn)R），每組4只。對照組不做特殊處理，IR組和Rev組小鼠接受亞致死劑量（6Gy）的全身照射，Rev組和Rev＋I(xiàn)R組用Rev干預(yù)，照射前7天至照射后30天灌胃給Rev（20mg／kg·day）。照射后30d，小鼠取外周血，每只小鼠抗凝管收集至少500μl外周血，2000rpm，4℃離心，分離血漿和血細(xì)胞，離心管收集上層血漿。取骨髓細(xì)胞Ficoll分離后收集單個核細(xì)胞。血漿和單個核細(xì)胞作為實驗樣本－80℃保存待后續(xù)檢測。

3 生化指標(biāo)測定 利用過氧化氫酶檢測試劑盒檢測骨髓單個核細(xì)胞和血液中的過氧化氫酶活性。利用Cu／Zn－MnSOD檢測試劑盒檢測血漿中SOD酶活性。各項指標(biāo)的測定均按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

4 統(tǒng)計學(xué)處理 本組數(shù)據(jù)采用SPSS16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，應(yīng)用多個樣本均數(shù)比較的方差分析檢驗，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并用最小顯著差法（LSD法）作兩兩比較，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 各組小鼠血漿中總SOD活性比較 見表1。照射組小鼠血漿中SOD活性明顯降低（P＜0．05），說明照射對總SOD影響較大；單獨給藥組與對照組比較差異不大，說明Res單獨給藥對總SOD有影響，但無顯著性差異（P＞0．05）。照射給藥組總SOD活性與照射組相比明顯升高（P＜0．05）。提示Res可以提升照射后小鼠血漿中總SOD活力，具有抗氧化作用。

2 各組小鼠血漿中Mn－SOD活性比較 見表1。照射組小鼠血漿中 Mn－SOD活性明顯降低（P＜0．05），說明照射對Mn－SOD有顯著影響；單獨給藥組的Mn－SOD活性與對照組比較明顯下降（P＜0．05）。說明Res可以降低Mn－SOD的活性。照射給藥組SOD活性與照射組相比升高不明顯，提示Res對照射后小鼠血漿中Mn－SOD影響不顯著。

3 各組小鼠血漿中CAT活性比較 見表2。照射組小鼠血漿中CAT活性與對照組相比沒有明顯變化，提示照射后1個月CAT活性有所恢復(fù)。單獨給藥組與對照組比較CAT活性明顯增加（P＜0．05）。說明Res可以提高血漿中CAT的活性。照射給藥組CAT活性與照射組相比明顯升高（P＜0．005）。提示Res可以明顯提升照射后小鼠血漿中CAT活力，具有抗氧化作用。射組小鼠骨髓單個核細(xì)胞中CAT活性與對照組相比并無顯著性差異（P＞0．05），提示照射1個月后小鼠骨髓單個核細(xì)胞中CAT活性有所恢復(fù)。單獨給藥組與對照組比較CAT活性明顯增加 （P＜0．05）。說明Res可以提高骨髓單個核細(xì)胞中CAT的活性。照射給藥組CAT活性與照射組相比明顯升高 （P＜0．005），提示Res可以明顯提升照射后小鼠血漿中CAT活力，具有抗氧化作用。

表1 白藜蘆醇對輻射誘導(dǎo)的小鼠血漿中總SOD和Mn－sod的活力影響（±s，n＝4）

表1 白藜蘆醇對輻射誘導(dǎo)的小鼠血漿中總SOD和Mn－sod的活力影響（±s，n＝4）

注：※ 與對照組比較，P＜0．05；△與照射組比較，P＜0 05

組 別 總SOD活力（U／ml）Mn－SOD活力（U／ml對照組 104．85±25．37 102．15±13．24）照射組 71．14±19．71※ 77．24±6．78※Res組 91．16±11．76 79．77±6．58※照射＋Res組 93．60±2．22△ 79．25±12．73

表2 白藜蘆醇對輻射誘導(dǎo)的小鼠血漿和骨髓單個核細(xì)胞中CAT活性的影響（±s，n＝4）

表2 白藜蘆醇對輻射誘導(dǎo)的小鼠血漿和骨髓單個核細(xì)胞中CAT活性的影響（±s，n＝4）

注：※ 與對照組比較，P＜0．05；＃與照射組比較，P＜0 05；△與Res組比較，P＜0．05

組 別 血漿中CAT活性（105 U／ml）骨髓單個核細(xì)胞中CA活力（105 U／ml）對照組 2．337±0．652 1．892±1．101 T照射組 2．358±0．182 1．892±1．101 Res組 3．383±0．823※ 2．407±0．499※照射＋Res組 3．026±40．839＃ 2．116±0．173＃△

討 論

Rev作為保健品已經(jīng)廣泛運用于多種疾病的預(yù)防，在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)疾病治療的臨床研究也已經(jīng)得到廣泛的開展，但作為輻射損傷防護(hù)劑卻鮮有報道。近期Wang等［4］研究表明：小鼠接受亞致死劑量的TBI，可以使HSC中NOX4高表達(dá)，生成ROS而導(dǎo)致HSC衰老并導(dǎo)致骨髓造血功能衰竭。Rev是一種強(qiáng)效的抗氧化劑，可以通過調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)降低組織中 ROS水平［5，6］。

近期，Zhang等［7～9］通過研究 Res保護(hù) TBI小鼠的骨髓造血功能衰竭是通過緩解氧化應(yīng)激。白藜蘆醇通過下調(diào)NOX4的表達(dá)，上調(diào)SOD2和GPX1的mRNA表達(dá)，從而降低HPC和HSC中ROS的水平而起到對造血系統(tǒng)輻射損傷的保護(hù)作用［7］。而機(jī)體內(nèi)存在一系列抑制和清除自由基的抗氧化酶和非酶系統(tǒng)，主要包括超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH－PX）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）等。其中SOD可與自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，對機(jī)體的氧化、抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，可以保護(hù)組織細(xì)胞免受損傷。CAT是機(jī)體內(nèi)廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解酶，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的作用。上述酶活力的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基能力大小。

本組使用TBI小鼠模型研究了Rev對IR導(dǎo)致造血細(xì)胞損傷防護(hù)作用的研究，對接受亞致死劑量全身照射的小鼠長期低劑量灌胃使用白藜蘆醇。結(jié)果表明，外周血血漿中Cu／Zn－SOD和總SOD活性給藥后與對照組相比可以有效的提高，促進(jìn)其抗氧化活性。骨髓單個核細(xì)胞和血漿中，照射給藥組與照射組相比，CAT的活性也顯著地提高。說明白藜蘆醇可以提高抗氧化酶活性行使其抗氧化作用。這些實驗結(jié)果進(jìn)一步從蛋白水平上說明了白藜蘆醇可以提高輻射損傷小鼠血漿中總SOD和CAT活性，提高骨髓單個核細(xì)胞中CAT的活性。也進(jìn)一步說明Rev可以通過提高抗氧化酶活性來達(dá)到輻射保護(hù)作用。

Rev是一種天然植物的提取物，成本低、毒性低，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于保健食品中，所以相比其他抗氧化劑在臨床上具有更廣泛地運用前景。在我們的研究中，小鼠輻射暴露前就給予Rev干預(yù)，所以對TBI后Rev的治療作用還未能闡明，今后的研究將探討輻射暴露后Rev的輻射損傷治療作用。

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