HPLC法測定單面針?biāo)幉闹邪柞r堿含量

王麗美，王 平，孫吉康，程 鵬，費(fèi)明亮

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

HPLC法測定單面針?biāo)幉闹邪柞r堿含量

王麗美，王 平，孫吉康，程 鵬，費(fèi)明亮

（中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004）

本文成功地建立了一種測定單面針?biāo)幉闹邪柞r堿含量的高效液相色譜（HPLC）分析方法。樣品采用超聲波輔助提取，色譜柱為SinoChrom ODS-BP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（50 : 50）為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，在波長236 nm處進(jìn)行白鮮堿含量檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白鮮堿在進(jìn)樣量為0.001 5～0.200 0 μg 范圍內(nèi)，峰面積和質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系（R2＝0.9995）；平均回收率為98.8%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.06%（n＝6）。該法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可用于對不同產(chǎn)地、不同藥用部位單面針中白鮮堿含量的測定。

單面針；白鮮堿；HPLC；含量測定

中藥材單面針，學(xué)名蜆殼花椒Zanthoxylum Dissitum Hemsl，又名山枇杷、蚌殼花椒、大葉花椒等[1]，屬蕓香科花椒屬常綠攀援或蔓生木質(zhì)藤本灌木植物，是我國南方重要的珍稀木本藥用植物資源[2]。根、莖及葉均供藥用，能祛風(fēng)活絡(luò)、散瘀止痛、解毒消腫，現(xiàn)已被開發(fā)為婦科千金片、婦科外用洗液等[3]。單面針中主要含有白鮮堿、γ-花椒堿多種生物堿[4-5]、內(nèi)酯類[3]和黃酮類化合物[6]等。

白鮮堿主要存在于蕓香科植物白鮮的根皮中，具有抗菌[7]、抗病毒[8]和抗昆蟲[9]等活性。近年來有研究表明白鮮堿具有良好的抗癌活性，在UV燈照射下白鮮堿能與DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中的嘧啶堿基形成加合物，此性質(zhì)與治療牛皮癬藥物8-甲氧補(bǔ)骨脂素相類似[10]。早在1995年湯俊等首次報(bào)道了蜆殼花椒中含有白鮮堿并成功得到了白鮮堿的單體，但有關(guān)單面針?biāo)幉闹邪柞r堿的含量測定方法至今未見報(bào)道。本文采用高效液相色譜分析法，以產(chǎn)于湖北恩施、湖南張家界和貴州銅仁3個(gè)主產(chǎn)區(qū)的單面針和經(jīng)人工快繁栽培于長沙的單面針為材料，首次測定了單面針根、莖部白鮮堿的含量，方法簡單易行，準(zhǔn)確率高，以期為單面針?biāo)幉牡目茖W(xué)利用提供參考，為評價(jià)和控制單面針?biāo)幉牡膬?nèi)在質(zhì)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單面針供試樣品分為野生資源和人工栽培兩類，野生樣品源自湖北恩施、湖南張家界、貴州銅仁3個(gè)單面針?biāo)幉闹鳟a(chǎn)區(qū)，由張家界市百草中藥材開發(fā)有限公司提供；人工栽培的單面針采自中南林業(yè)科技大學(xué)植物園，由該校王平教授課題組經(jīng)人工快繁栽培而得。所有供試樣品均由中南林業(yè)科技大學(xué)喻勛林教授鑒定為蕓香科花椒屬單面針?biāo)幉腪anthoxylum Dissitum Hemsl4年生植物，均達(dá)到企業(yè)入藥標(biāo)準(zhǔn)。取單面針根、莖，干燥后粉碎，過80目篩備用。對照品白鮮堿（中國藥品生物制品檢定所，批號：111654-200301），乙腈（西安化學(xué)試劑廠，色譜純），磷酸二氫鈉（分析純），超純水（自制）。

Agilent 1200 高效液相色譜儀（包括VWD紫外可變波長檢測器，四元低壓梯度泵，真空脫氣機(jī)），ELGA超純水儀，紫外分光光度計(jì)（UV-2450）、超聲波清洗儀（上海聲彥超聲波儀器有限公司SCQ25-6），電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司AL204），萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有效公司DFY-01）。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

依利特SinoChrom ODS-BP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉緩沖（50∶50），柱溫為25 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長為236 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品白鮮堿 10 mg置于10 mL容量瓶中，加80%乙醇溶解并稀釋到刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL的對照品溶液，4 ℃?zhèn)浯妗?/p>

1.2.3 供試品溶液的制備

分別取不同產(chǎn)地的單面針根、莖部樣品粉末，約0.25 g，精密稱量，分別加80%乙醇20 mL，超聲提取30 min，提取液在5 000 轉(zhuǎn)/分下離心10 min，水浴揮發(fā)溶劑并定容至5 mL容量瓶，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

取白鮮堿對照品溶液和單面針樣品溶液在190～ 400 nm 波長范圍內(nèi)掃描, 最大吸收波長分別為232 nm 和222 nm，掃描圖見圖1(A)、(B)。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇236 nm 作為檢測波長。

圖1 白鮮堿對照品溶液紫外掃描( A圖 ) 和單面針根部樣品溶液紫外掃描（B圖）Fig. 1 Ultraviolet and visible absorption spectrum of dictamnine reference substance (A) and that of Z. dissitum root samples (B)

2.1.2 流動(dòng)相及流速的確定

我們比較了流動(dòng)相乙腈-磷酸二氫鈉緩沖液(45∶55)，v=1.0 mL/min；乙腈-磷酸二氫鈉緩沖液(45∶55)，v=0.8 mL/min；乙腈-磷酸二氫鈉緩沖液(50∶50)，v=0.8 mL/min 3個(gè)比例對樣品的分離，結(jié)果顯示，當(dāng)乙腈和磷酸二氫鈉緩沖液的比例達(dá)到50∶50，流速v=0.8 mL/min時(shí)可以使樣品分離達(dá)到要求，且保留時(shí)間較短，故最終選擇乙腈-磷酸二氫鈉緩沖液(50∶50)，v=0.8 mL/min作為檢測條件。

白鮮堿對照品溶液及單面針供試品溶液在前述最佳洗脫條件下進(jìn)樣測定，得色譜圖(圖2(A)、(B))。由圖可得，白鮮堿峰形對稱、尖銳，具有良好的分離效果。

2.2 線性關(guān)系考察

圖2 白鮮堿對照品溶液色譜( A ) 和單面針根部樣品溶液( B ) 色譜Fig. 2 HPLC chromatograms of dictamnine reference substance (A) and that of Z. dissitum root samples (B)

精密稱取白鮮堿對照品溶液1 mL置100 mL量瓶中，加80%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密吸取濃度為0.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1、2.5、5、7.5、10 mL分別置10 mL 量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別制成含白鮮堿0.001、0.002 5、0.005、0.007 5、0.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。再從0.007 5 mg/mL溶液中精密吸取1 mL，置100 mL 量瓶中，加80%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成含白鮮堿0.075 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以白鮮堿標(biāo)準(zhǔn)品含量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=19 206X+62.031（R2=0.999 5），表明在0.001 5～0.2 μg范圍內(nèi)，白鮮堿的峰面積積分值與含量有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取白鮮堿對照品溶液20 μL，按照1.2.1所述色譜條件，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定白鮮堿峰面積值，結(jié)果RSD為0.72%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取張家界產(chǎn)的單面針根部粉末，按供試品溶液的制備方法配制成供試品溶液，按照1.2.1所述色譜條件，分別于第0、2、4、6、8 h精密吸取供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。結(jié)果由峰面積計(jì)算RSD= 2.47%，表明本實(shí)驗(yàn)樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取張家界產(chǎn)的單面針根部粉末，依法分別制備5份供試品溶液，按照1.2.1所述色譜條件進(jìn)樣測定，其RSD為0.99%，表明本法重現(xiàn)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取張家界產(chǎn)的單面針根部粉末按前述方法重復(fù)測定白鮮堿的含量(n=3)，同時(shí)再按高、中、低3種濃度梯度分別做加標(biāo)樣品分析（n=6），進(jìn)樣測定含量，白鮮堿平均回收率為98.8%，RSD為3.06% (n= 6)，結(jié)果見表1。

表1 單面針中白鮮堿加樣回收率Table 1 Adding sample recovery rate of dictamnine in Z. dissitum (n=6)

2.7 單面針樣品白鮮堿含量測定

按上述供試品溶液的制備方法和測定條件，測定并比較湖南張家界、湖北恩施、貴州銅仁產(chǎn)單面針和湖南長沙人工栽培的單面針根、莖部白鮮堿的含量，每一份樣品平行測定三次，記錄白鮮堿面積積分值，外標(biāo)法計(jì)算白鮮堿的平均含量，結(jié)果見表2。

表2 不同產(chǎn)地單面針根、莖部白鮮堿的含量Table 2 Contents of dictamnine in roots and stems of Z.Dissitum from different production habitats

對以上數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析可知，同一產(chǎn)地的單面針中白鮮堿含量具有一定的器官特異性，普遍表現(xiàn)為根部含量高于莖部，平均高達(dá)18.20倍；與野生單面針相比，人工栽培于長沙的單面針中白鮮堿含量較低，但是根、莖部含量相差較??；不同產(chǎn)地單面針根部白鮮堿含量呈極顯著差異（P＜0.01），湖北恩施和貴州銅仁莖部含量差異不顯著（P=0.279＞0.05）。綜合比較單面針根、莖部白鮮堿含量情況，建議制藥企業(yè)宜多選用湖南張家界地區(qū)單面針?biāo)幉模纱_保良好的藥材品質(zhì)和質(zhì)量。

3 討論與結(jié)論

現(xiàn)階段國內(nèi)尚未有統(tǒng)一的白鮮堿含量測定標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的檢測白鮮堿的方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法和高效液相色譜法等。相比較其他方法，HPLC法具有直接、快速、簡便的特點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥成分的檢測中[11-12]。李艷園[13]、王森[14]等采用HPLC法檢測白鮮皮和其制劑中白鮮堿的含量，黃端華等[15]建立了毛細(xì)管電泳-紫外檢測法同時(shí)分離檢測白鮮皮中葫蘆巴堿、白鮮堿和膽堿的分析體系，但這些樣品中白鮮堿的含量較高。目前對單面針?biāo)幉闹邪柞r堿的精確、定量分析鮮見文獻(xiàn)報(bào)道。

本文成功地建立了一種測定白鮮堿含量的高效液相色譜法，并對不同產(chǎn)地、不同部位的單面針中白鮮堿含量進(jìn)行測定和比較。采用80%乙醇超聲輔助提取，最佳色譜條件為：以乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液（50:50）為流動(dòng)相，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，在236 nm波長處進(jìn)行檢測。方法簡便易行，數(shù)據(jù)可靠，為單面針?biāo)幉牡馁|(zhì)量檢測標(biāo)準(zhǔn)提供了一種科學(xué)的、可行的檢測方法，同時(shí)該檢測方法的建立為單面針的藥用價(jià)值進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)和理論指導(dǎo)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：單面針?biāo)幉母?、莖部均含有白鮮堿，且同一產(chǎn)地根部白鮮堿含量明顯高于莖部，馬英姿等[16]曾對蜆殼花椒采用組織化學(xué)定位方法研究生物堿在植株體內(nèi)的分布，結(jié)果表明根中生物堿含量大于莖中含量，與本研究結(jié)果一致；不同產(chǎn)地單面針?biāo)幉闹邪柞r堿含量差異較大，可能是因?yàn)橹参镉行С煞值姆e累不僅受植物發(fā)育進(jìn)程的調(diào)控，還受水、光照、溫度、空氣、土壤等多種環(huán)境因子的調(diào)控[17-18]；與野生資源相比，人工栽培的單面針?biāo)幉闹邪柞r堿含量較低，但在根、莖部分布較均勻，這種現(xiàn)象究竟是由特定的環(huán)境因子和氣候特征引起的還是在單面針人工快繁的某些環(huán)節(jié)發(fā)生了變化？何種機(jī)理尚需進(jìn)一步的深入研究。

本實(shí)驗(yàn)僅對湖南張家界、湖北恩施和貴州銅仁及人工栽培于長沙的單面針白鮮堿含量進(jìn)行測定分析，未對其他產(chǎn)地的單面針中白鮮堿及其他有效成分的含量進(jìn)行研究，具有一定的局限性。還有待于對單面針?biāo)幉牡牟煌L年限、采收時(shí)節(jié)等更多的代表性的樣品進(jìn)行分類測定，開展單面針?biāo)幉闹卸嘀笜?biāo)成分的定量測定和指紋圖譜的定性測定，以期為單面針?biāo)幉牡挠行С煞痔峁└鼮槿娴男畔?，進(jìn)而使單面針?biāo)幉牡馁|(zhì)量評價(jià)方法更為完善。

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Quantitative determination of dictamnine in Zanthoxylum dissitum Hemsl by using HPLC

WANG Li-mei, WANG Ping, SUN Ji-kang, CHENG Peng, FEI Ming-liang
(School of Life Science & Technology, Central South University of Forestry &Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

An analysis method using high performance liquid chromatographic for determining dictamnine in Zanthoxylum dissitum Hemsl had been successfully established. In the experiments, dictamnine was obtained by ultrasonic extraction and separated on SinoChrom ODS-BP C18column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) and the mobile phase was mixture liquid of acetonitrile and 0.01 mol/L NaH2PO3(50︰50, V/V); the flowing speed of the mobile phase was 0.8 mL/min, and the wavelength for detecting dictamnine was 236 nm. The results indicate that when the injection volume of the dictamnine ranged from 0.0015 to 0.200 0 μg, a significant linear relationship showed between the peak area and the mass concentration (R2=0.9995), the average recovery rate of dictamnine was 98.8%,and the relative standard deviation (RSD) was 3.06% (n=6). In conclusion, the established analysis method possessed good accuracy,reliability and high repeatability, which made it a suitable detection method for determining dictamnine in Z. dissitum from different origin place and medicinal parts.

Zanthoxylum dissitum; dictamnine; HPLC; determination of content

S727.34

A

1673-923X(2013)06-0075-04

2013-01-18

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201204606）；高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（200943921110002）

王麗美（1987-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物

王 平（1964-），男，湖南常德人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事生態(tài)學(xué)領(lǐng)域方面的研究；E-mail：csfuwp@163.com

[本文編校：吳 彬]