Cks1在老年肝細胞癌中的表達及臨床意義

張秀梅， 顧金松， 劉 曙， 孫成福， 譚 進

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤，全世界每年大約有100萬人死于肝癌，其中老年人是高發(fā)人群。盡管手術(shù)切除和肝移植已經(jīng)顯著改善了小肝癌及無轉(zhuǎn)移肝癌患者的生存時間，但是晚期肝癌患者的預(yù)后仍然較差[1]。細胞周期蛋白依賴性激酶調(diào)節(jié)亞基1(cyclin kinase subunit 1，Cks1)是高度保守的細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Suc1/Cks蛋白家族成員之一，目前已經(jīng)有大量的研究表明Cks1在多種腫瘤的病理組織中(包括胃癌、乳腺癌和肝癌等)高表達，并發(fā)揮著一定的生物學(xué)功能[2-4]。本研究采用免疫組化SP法檢測Cks1在老年肝細胞癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達，分析其在肝細胞癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達水平及其與臨床病理特征的聯(lián)系，探討其在老年肝細胞癌診治方面的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 肝癌及對應(yīng)癌旁組織來源于本院2011年6月至2013年3月期間住院肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，共60例。其中男33例，女27例，年齡61～80歲，平均年齡(71.12±3.20)歲。HBV感染32例(53.3%)，肝硬化38例(63.3%)，瘤體積≥5 cm有34例(56.7%)，肝內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移31例(51.7%)。所有患者術(shù)前均未行放療、化療及射頻消融治療，所有組織標(biāo)本經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實為肝細胞癌。所有標(biāo)本于術(shù)中離體30 min內(nèi)取材，經(jīng)10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋、切片備用。HCC組織根據(jù)Edmondson標(biāo)準(zhǔn)分級：Ⅰ級12例；Ⅱ級21例；Ⅲ級12例；Ⅳ級15例。

1.2 檢測方法 免疫組化SP法檢測肝癌及對應(yīng)癌旁組織中Cks1的表達。鼠抗人Cks1單克隆抗體(sc-376663)購自美國SANTA CRUZ公司；免疫組化試劑盒購自南京生興生物技術(shù)有限公司。對石蠟塊進行4 μm連續(xù)切片制片。蠟塊脫蠟后枸櫞酸鹽緩沖液進行熱抗原修復(fù)，然后30% H2O2室溫孵育15 min后，滴加山羊血清封閉孵育20 min，再以1∶100比例稀釋的Cks1一抗加于標(biāo)本后，置于濕盒內(nèi)4 ℃過夜。陰性對照以PBS取代一抗。滴加生物素標(biāo)記的山羊鼠工作液，37 ℃溫箱孵育30 min。滴加辣根酶(HRP)標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，孵育30 min。滴加DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，梯度脫水至透明。顯微鏡下觀察，成像系統(tǒng)拍照，統(tǒng)計分析實驗結(jié)果。

1.3 結(jié)果判定 用染色強度聯(lián)合陽性細胞百分比進行評分。染色強度分為4等級：0分，陰性；1分，弱陽性；2分，中度陽性；3分，強陽性。陽性細胞百分比分級：陽性細胞≤5%=0分，6%～25%=1分，26%～50%=2分，51%～75%=3分，>75%=4分。染色強度和陽性細胞百分比評分相乘≥1分認(rèn)為Cks1蛋白陽性表達。計數(shù)每一強度的視野數(shù)，根據(jù)下列計算公式計算每張切片的平均染色強度：IS(intensity score)=Σ{(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)}，F(xiàn)=%×10視野[5]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，全部資料均為二分類資料，組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cks1與性別、HBV感染、肝硬化的關(guān)系 肝細胞癌中Cks1的陽性表達與患者的性別、有無HBV感染、有無肝硬化以及腫瘤的大小無關(guān)，均P>0.05，見表1。

表1 Cks1表達與性別、HBV感染、肝硬化及腫瘤大小的關(guān)系

2.2 肝癌及對應(yīng)癌旁組織中Cks1表達的對比 Cks1在肝細胞癌組織中的陽性表達率為71.7%(43/60)，顯著高于對應(yīng)的癌旁組織的20.0%(12/60)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=32.26，P<0.001)，提示Cks1在肝細胞癌組織中高表達，在癌旁組織中低表達，Cks1可以作為肝細胞癌組織的診斷指標(biāo)。見表2。

2.3 Cks1表達強度與肝癌組織病理參數(shù)的相關(guān)性由表3可見，Cks1蛋白表達強度與肝細胞癌分化程度顯著相關(guān)(r=0.817，P<0.05)，癌細胞分化愈差，Cks1蛋白表達愈弱；而Cks1蛋白表達強度與癌旁組織的分化程度無關(guān)(r=0.112，P>0.05)。

3 討論

細胞周期抑制蛋白p27低表達與多種腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)，p27蛋白通過泛素蛋白酶體途徑降解，泛素連接酶Sphase kinase protein2(SKP2)負責(zé)識別p27，但SKP2只有結(jié)合Cks1之后才能識別p27并導(dǎo)致其泛素化降解[6]。研究認(rèn)為Cks1的表達與腫瘤分化程度和患者的生存期顯著相關(guān)，Cks1在結(jié)、直腸癌中的表達與腫瘤的分化程度及p27的表達呈顯著負相關(guān)[7]，而在胃癌中Cks1同樣高表達，并且與腫瘤分化程度相關(guān)[8]。因此我們推測，Cks1在多種惡性腫瘤中存在異常高表達。其在細胞周期的調(diào)節(jié)中具有重要作用。

肝癌惡性程度高，臨床癥狀隱匿，預(yù)后較差，目前尚缺乏完全反應(yīng)其生物學(xué)特性的臨床指標(biāo)。本研究通過檢測Cks1在老年肝細胞癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達，探討其在老年肝細胞癌及其癌旁組織中的診治意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cks1在肝細胞癌組織中的陽性表達水平顯著高于對應(yīng)的癌旁組織，其表達程度與肝癌Edmonson分級顯著相關(guān)。提示了Cks1的陽性表達程度與肝癌的增殖能力和惡性程度有著密切的聯(lián)系，Cks1在肝癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要的協(xié)同作用。

總之，Cks1在肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，檢測老年肝癌組織中的Cks1表達情況對患者的預(yù)后預(yù)測和臨床個體化治療具有一定的指導(dǎo)意義。

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