小麥TaLTR基因的克隆及初步表達(dá)分析

摘要：以小麥山融3號(hào)為試驗(yàn)材料，克隆了TaLTR cDNA序列（Low temperature-responsive RNA-binding protein）。序列分析表明，TaLTR序列包含完整的ORF區(qū)，編碼蛋白含有162個(gè)氨基酸，其氨基端包含一個(gè)RRM（RNA recognition domain）超家族保守的結(jié)構(gòu)域，羧基端則富含甘氨酸；經(jīng)半定量RT-PCR分析，表明TaLTR參與低溫、干旱、鹽脅迫逆境反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：小麥；TaLTR基因；RT-PCR；逆境脅迫

中圖分類(lèi)號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）01-0025-05

小麥?zhǔn)羌s35%世界人口的主要糧食，其種植面積約占谷類(lèi)作物種植總面積的三分之一。低溫、干旱是影響小麥生產(chǎn)的主要非生物脅迫因子，研究小麥對(duì)干旱、低溫等脅迫的響應(yīng)機(jī)制，發(fā)掘逆境應(yīng)答相關(guān)蛋白基因，對(duì)于研究小麥抗逆分子機(jī)制及增強(qiáng)抗逆性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

非生物逆境脅迫下，涉及離子轉(zhuǎn)運(yùn)與平衡、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、細(xì)胞防御和解毒、能量產(chǎn)生與運(yùn)輸以及滲透調(diào)節(jié)等生理代謝的大量基因的表達(dá)都會(huì)發(fā)生變化[1]。為此，山東大學(xué)夏光敏實(shí)驗(yàn)室利用SSH、基因芯片及雙向電泳-質(zhì)譜分析等方法，對(duì)耐鹽抗旱小麥新品種山融3號(hào)鹽或干旱脅迫前后的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，獲得了大量表達(dá)模式發(fā)生變化的基因或ESTs信息[2～4]。本研究從山融3號(hào)鹽脅迫前后的表達(dá)譜芯片結(jié)果中選取1個(gè)表達(dá)變化的EST（EST ID：WL403），對(duì)其進(jìn)行了基因克隆、初步表達(dá)分析。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)材料

111材料小麥（Triticum aestivum L）品種山融3號(hào)，由山東大學(xué)夏光敏實(shí)驗(yàn)室提供；菌株：大腸桿菌（Escherichia coil） DH5α（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

112試劑Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；常用內(nèi)切酶、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit為Fermentas公司產(chǎn)品；Taq酶使用寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品Mighty Amp DNA Polymerase （hot start）；pEASY-T3載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

12方法

121總RNA提取和cDNA合成Trizol法提取各取樣時(shí)間點(diǎn)的小麥總RNA。根據(jù)Fermentas的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用說(shuō)明，反轉(zhuǎn)錄合成小麥cDNA的第一條鏈。

122TaLTR基因的全長(zhǎng)cDNA克隆分析小麥基因芯片和雙向電泳結(jié)果，篩選小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)，從對(duì)應(yīng)ESTs中選擇克隆一個(gè)鹽脅迫下表達(dá)發(fā)生變化的基因。根據(jù)EST文庫(kù)中拼接高度同源的ESTs序列，設(shè)計(jì)特異性引物TaLOW-S1/A1，擴(kuò)增獲得153 bp的小片段（TaLOW-S1：5′-TTAGGGTTTAGTAGTAGCGGGG-3′；TaLOW -A1：5′-GTCAGTGATGATCTTGGAGTCG-3′），經(jīng)5′-和3′-RACE擴(kuò)增，拼接后獲得556 bp cDNA序列。利用ORF finder 程序（http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）預(yù)測(cè)拼接序列的開(kāi)放閱讀框（ORF）。

使用Primer Premier 50 軟件在預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框兩側(cè)設(shè)計(jì)特異引物TaLTR-F1/R1，得到一對(duì)能有效擴(kuò)增TaLTR的引物（TaLTR-F1：5′-GAATGGCGGACGTCGAGT-3′；TaLTR -R1：5′-ATCGGGTAACTAGGATAACTGG-3′），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序。

PCR程序?yàn)椋?8℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，32循環(huán)；72℃ 10 min；16℃保存。

123TaLTR序列分析利用網(wǎng)站資源對(duì)TaLTR基因進(jìn)行序列分析。NCBI進(jìn)行nBLAST同源性比對(duì)；使用http：//auexpasyorg/ tools/dnahtml翻譯TaLTR氨基酸序列；以InterPro Scan為工具分析蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用MEGA31軟件構(gòu)建TaLTR基因編碼蛋白的同源系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；運(yùn)用DNAMAN、clustalX軟件構(gòu)建多重序列比對(duì)圖譜。

124基于半定量RT-PCR的初步表達(dá)分析挑選生長(zhǎng)至兩葉一心、健壯的山融3號(hào)小麥進(jìn)行如下脅迫處理：200 mmol/L NaCl泡根處理72 h，然后恢復(fù)72 h；18% PEG 6000浸根處理72 h，隨后恢復(fù)72 h；對(duì)照為正常條件下同期生長(zhǎng)的健康植株。分別在0、05、1、2、6、12、24、48、72 h恢復(fù)48 h和恢復(fù)72 h取樣，液氮冷凍后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取山融3號(hào)小麥植株脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的根和葉，Trizol法提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，以TaActin-S（5′-AGCCATACCGTGCCAATC-3′）和TaActin-A（5′-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3′）作為擴(kuò)增引物，獲得558 bp左右的Actin內(nèi)參產(chǎn)物片段。以TaLTR-S1、TaLTR-A1作為擴(kuò)增引物，獲得153 bp左右目的基因產(chǎn)物。Actin基因PCR程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。以Actin基因獲得的cDNA模板量和循環(huán)次數(shù)、最佳擴(kuò)增程序獲得單一的TaLTR目的產(chǎn)物帶。PCR條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。

2結(jié)果與分析

21TaLTR基因的cDNA克隆

根據(jù)小麥EST WL403序列在NCBI中搜索與其同源的小麥ESTs序列，共獲得321條序列。將這321條序列和5′-、3′-RACE擴(kuò)增序列進(jìn)行拼接獲得1個(gè)長(zhǎng)度為689 bp的contig。進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異性引物TaLTR-F1和TaLTR-R1擴(kuò)增包括完整ORF的cDNA序列，得到約556 bp的產(chǎn)物（圖1），命名為T(mén)aLTR（GI：Kc408381）。回收目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEASY-T3載體中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖2）和序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列見(jiàn)圖3。

22TaLTR基因的序列分析和同源性比較

對(duì)獲得的556 bp cDNA序列初步分析表明，該序列包含完整的ORF區(qū)，預(yù)測(cè)編碼的蛋白含有162個(gè)氨基酸。運(yùn)用ExPasy、InterPro網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，TaLTR基因編碼的蛋白氨基端包含一個(gè)RRM（RNA recognition motif domain）超家族保守的結(jié)構(gòu)域，羧基端則富含甘氨酸（圖4）。

將TaLTR基因推導(dǎo)預(yù)測(cè)的氨基酸序列在NCBI上作BLAST比較，結(jié)果顯示，其RRM結(jié)構(gòu)域氨基酸與小麥TaGRP2、大麥GRP HORVU、水稻OsGRP1、玉米grp1、擬南芥AtGRP7的RRM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列一致性分別為99%、99%、79%、81%、81%，說(shuō)明該結(jié)構(gòu)域具有較強(qiáng)的保守性（圖5）。運(yùn)用MEGA31軟件構(gòu)建了TaLTR基因編碼的蛋白與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果表明，來(lái)源于單子葉植物的蛋白序列與雙子葉植物的同源蛋白明顯分為兩支，而在單子葉植物這一支上TaLTR與小麥TaGRP2、大麥GRP HORVU聚在一起（圖6）。

迄今為止，尚未見(jiàn)對(duì)小麥TaGRP2和大麥GRP HORVU基因功能研究的報(bào)道。對(duì)擬南芥同源基因AtGRP7基因功能的研究發(fā)現(xiàn)，AtGRP7是冷脅迫過(guò)程中的一個(gè)RNA伴侶因子，其N(xiāo)-端的RRM結(jié)構(gòu)域在冷脅迫適應(yīng)過(guò)程中起關(guān)鍵作用[5]。研究還發(fā)現(xiàn)，AtGRP7基因通過(guò)抑制開(kāi)花抑制子FLC的表達(dá)控制植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換[6]。不同物種的TaLTR同源蛋白的RRM結(jié)構(gòu)域具有極高的保守性，預(yù)示它們?cè)诠δ苌峡赡芤簿哂心承┫嗨菩?。小麥TaLTR基因是否具有擬南芥AtGRP7基因同樣的功能還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

23基于半定量RT-PCR的TaLTR基因在干旱、鹽和低溫脅迫下的初步表達(dá)分析

無(wú)論在根中還是在葉中，干旱、高鹽和低溫脅迫都可誘導(dǎo)TaLTR基因的表達(dá)量增加。18% PEG6000和200 mmol/L NaCl誘導(dǎo)的TaLTR基因表達(dá)在受脅迫6～12 h達(dá)到峰值，之后會(huì)逐漸下降恢復(fù)到正常水平（圖7A、7B和7D、7E）；而該基因的表達(dá)在4℃低溫處理05 h到72 h持續(xù)升高，恢復(fù)到室溫后基因表達(dá)量也相應(yīng)恢復(fù)到原有水平（（圖7C和7F）。上述結(jié)果表明，TaLTR基因可以應(yīng)答干旱和高鹽的脅迫，但其表達(dá)增強(qiáng)時(shí)間很短，有可能是一種應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果；而在小麥適應(yīng)冷脅迫過(guò)程中，該基因無(wú)論根中還是葉中表達(dá)量持續(xù)升高，推測(cè)它在應(yīng)答低溫脅迫中起更重要作用。結(jié)合序列同源性分析的結(jié)果，初步推測(cè)，TaLTR基因在小麥冷脅迫適應(yīng)過(guò)程中，可能與小麥花期轉(zhuǎn)換、調(diào)控春化作用相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。

3結(jié)論

本研究克隆了小麥山融3號(hào)TaLTR基因，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行序列分析以及RT-PCR半定量初步表達(dá)分析，推測(cè)TaLTR基因可能在應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)起到重要作用。該基因同時(shí)還受到高鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。TaLTR基因具體行使哪些功能，是否可調(diào)控春化相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而影響植物開(kāi)花時(shí)間，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這些問(wèn)題的解決或許將有助于揭示作物低溫應(yīng)答機(jī)制，為研究小麥抗逆生理機(jī)制以及抗逆育種提供基礎(chǔ)材料。

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