單子葉植物表達(dá)載體pUN3300的構(gòu)建

摘要：植物雙元表達(dá)載體在植物基因工程研究中具有重要作用，表達(dá)載體所包含的結(jié)構(gòu)元件，如啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、篩選標(biāo)記等，對(duì)植物遺傳轉(zhuǎn)化效率、外源基因表達(dá)強(qiáng)度及遺傳穩(wěn)定性等具有重要影響。本研究中，為提高目的基因?qū)巫尤~植物的遺傳轉(zhuǎn)化效率，對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA3300進(jìn)行改造，在原有以bar基因作為選擇標(biāo)記的基礎(chǔ)上，采用不完全酶切的方法添加了Ubiquitin啟動(dòng)子，經(jīng)酶切、測(cè)序表明，植物雙元表達(dá)載體pUN3300構(gòu)建成功。該載體對(duì)于研究外源基因功能、植物性狀改良及新品種的培育，具有重要的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)巫尤~植物；表達(dá)載體；pUN3300；Ubiquitin啟動(dòng)子；bar基因

中圖分類號(hào)：Q781文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）01-0034-04

植物雙元表達(dá)載體是植物基因工程研究的重要組成部分。通過(guò)植物表達(dá)載體，外源目的基因可進(jìn)入宿主細(xì)胞并高效表達(dá)，為闡明基因功能、利用基因資源改良作物種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)[1～3]。獲得穩(wěn)定、高效的植物雙元表達(dá)載體是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化研究的重要內(nèi)容之一。目前，雖已有pBR121、pCAMBIA等系列的商業(yè)化表達(dá)載體出售，但并不能完全滿足實(shí)驗(yàn)需求，因此，必須根據(jù)實(shí)際需要對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行改造。表達(dá)載體上攜帶的抗性標(biāo)記基因是篩選轉(zhuǎn)化體的有效手段，但同時(shí)也帶來(lái)了生態(tài)環(huán)境及食品安全方面的潛在隱患，影響了大眾對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的接受。而以除草劑抗性bar 基因作為篩選標(biāo)記，具有一定的生物安全性，客觀上可消除人們的顧慮[4]。因此本研究中，選取以bar 基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的商業(yè)化表達(dá)載體pCAMBIA3300為基礎(chǔ)，通過(guò)不完全酶切等方法添加了單子葉植物高效、專一性啟動(dòng)子Ubiquitin，構(gòu)建并獲得了適于單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體pUN3300，為外源目的基因?qū)巫尤~植物的遺傳轉(zhuǎn)化提供了有力的分子生物學(xué)工具。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

植物表達(dá)載體pCAMBIA3300、含有Ubiquitin啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pUN1301由本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金公司，各種限制性內(nèi)切酶、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、T4 DNA連接酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，其他各種試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

12試驗(yàn)方法

121Ubiquitin啟動(dòng)子表達(dá)元件的獲得用HindⅢ單酶切植物表達(dá)載體pUN1301，電泳回收后用EcoRⅠ不完全酶切，產(chǎn)物經(jīng)08%瓊脂糖凝膠電泳，回收產(chǎn)物2 240 bp，即為Ubiquitin啟動(dòng)子表達(dá)元件。

122單子葉植物表達(dá)載體pUN3300的構(gòu)建用Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ雙酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA3300，獲得長(zhǎng)度為8 400 bp的產(chǎn)物，該回收產(chǎn)物與上步獲得的Ubiquitin啟動(dòng)子表達(dá)元件混合后，經(jīng)T4連接酶16℃連接過(guò)夜。熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板，在含有Kan （50 mg/L）的培養(yǎng)基上篩選，篩選到的陽(yáng)性克隆經(jīng)質(zhì)粒提取，獲得載體pUN3300。

123單子葉植物表達(dá)載體pUN3300的鑒定利用DNAMAN軟件，分別在Ubiquitin啟動(dòng)子、bar基因上設(shè)計(jì)PCR檢測(cè)引物UbiF：5′-CAAATCCACCCGTCGGCACCTC-3′；BarR：5′- CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3′，預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)2 350 bp。PCR檢測(cè)程序?yàn)椋?5℃變性30 s，64℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)特異條帶。將鑒定正確的菌液培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)PstⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定，構(gòu)建正確的植物表達(dá)載體命名為pUN3300（圖1）。

2結(jié)果與分析

21Ubiquitin啟動(dòng)子表達(dá)元件的獲得

pUN1301質(zhì)粒由pCAMBIA1301在多克隆位點(diǎn)處克隆入一個(gè)Ubiquitin啟動(dòng)子表達(dá)元件后得到。由于Ubiquitin啟動(dòng)子內(nèi)部約1 400 bp處含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，為獲得完整的Ubiquitin啟動(dòng)子表達(dá)元件，經(jīng)HindⅢ單酶切后，其回收產(chǎn)物進(jìn)一步用稀釋10倍的EcoRⅠ酶切3 min，進(jìn)行不完全酶切。

電泳結(jié)果如圖2所示，兩條酶切條帶分別為2 017 bp和1 400 bp，其中2 017 bp是目的條帶，進(jìn)一步將其切膠回收，獲得包含Ubiquitin啟動(dòng)子和Nos末端的Ubiquitin啟動(dòng)子表達(dá)元件。

22單子葉植物表達(dá)載體pUN3300的構(gòu)建與檢測(cè)

將pCAMBIA3300載體酶切產(chǎn)物與Ubiquitin啟動(dòng)子表達(dá)元件連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，通過(guò)PCR與酶切鑒定質(zhì)粒重組情況。利用在Ubiquitin啟動(dòng)子和bar基因上設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得大小為2 350 bp的條帶（圖3 ），與預(yù)期相符。將鑒定正確的菌液提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，分別獲得了1 800、1 600、600 bp三條帶（圖4），與預(yù)期大小相符。結(jié)果表明植物表達(dá)載體pUN3300構(gòu)建成功。

3結(jié)論與討論

生物及環(huán)境安全是全球所共同關(guān)注的重大問(wèn)題。pCAMBIA3300載體作為pCAMBIA系列商業(yè)化載體的一種，其以bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，無(wú)基因多效性。bar基因編碼產(chǎn)物膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（PAT）具有熱穩(wěn)定性和消化穩(wěn)定性，與已知毒素和過(guò)敏原均非同源。目前已證明其對(duì)人體和動(dòng)物安全無(wú)毒， 同食物中的DNA一樣安全[5]。同時(shí)，草丁膦作為一種生物除草劑， 在土壤中易被快速分解， 對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)毒、無(wú)害。因此，bar基因作為迄今應(yīng)用最多的抗除草劑基因，也是唯一成功應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的選擇標(biāo)記[6]，目前已成功地用于小麥、水稻、玉米、大麥、油菜等作物的遺傳轉(zhuǎn)化。

在植物基因工程研究中， 選擇高效專一的啟動(dòng)子是外源目的基因能否在目標(biāo)植物中進(jìn)行高效表達(dá)的關(guān)鍵。pCAMBIA3300載體雖不含GUS 等報(bào)告基因，背景相對(duì)干凈，有利于后期轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的推廣和應(yīng)用，但載體本身并不含有啟動(dòng)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子元件，鑒于本研究的轉(zhuǎn)化目標(biāo)主要為水稻等單子葉植物，因此構(gòu)建一個(gè)能夠使外源基因在單子葉植物中高效、穩(wěn)定表達(dá)的植物表達(dá)載體尤為關(guān)鍵。本研究中所選用的玉米泛素Ubiquitin啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子， 具有啟動(dòng)效率高、甲基化程度相對(duì)較低、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，其在單子葉植物中活性極強(qiáng)，啟動(dòng)的目的基因在單子葉植物中可持續(xù)、高效的表達(dá)。目前的研究表明，在水稻中，Ubiquitin啟動(dòng)子誘導(dǎo)的GUS和bar基因的表達(dá)水平顯著高于35S啟動(dòng)子，在水稻等單子葉植物分子育種中具有很大的應(yīng)用潛力。因此，本研究選擇了Ubiquitin啟動(dòng)子作為改造植物表達(dá)載體的首選啟動(dòng)子[5]。

試驗(yàn)中，由于Ubiquitin啟動(dòng)子內(nèi)部含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，因此采用不完全酶切的方法加以分離。由于EcoRⅠ活性較強(qiáng)，試驗(yàn)中為避免完全酶切，我們分別對(duì)不同的內(nèi)切酶濃度進(jìn)行了嘗試，最終確定將酶稀釋10倍加以應(yīng)用并分別在酶切1、3、5、10 min后電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在內(nèi)切酶消化3 min時(shí)酶切效果較好。同時(shí)，酶切產(chǎn)物經(jīng)08%瓊脂糖凝膠電泳，可使2 017 bp的不完全酶切條帶與1 400 bp的完全酶切條帶較好地分離，通過(guò)對(duì)上述條件的逐一優(yōu)化，最終獲得了較理想的結(jié)果。目前，涉及不完全酶切的相關(guān)文獻(xiàn)較少，該方法的應(yīng)用及相關(guān)試驗(yàn)條件仍在不斷地摸索和優(yōu)化中。

本研究獲得了以bar 基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，以專一性啟動(dòng)子Ubiquitin為啟動(dòng)元件的適于單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的高效表達(dá)載體pUN3300，為進(jìn)一步利用外源目的基因?qū)巫尤~植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得安全性較高的轉(zhuǎn)基因材料，進(jìn)而改良作物種質(zhì)資源提供了良好的分子生物學(xué)工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)：

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