布氏乳桿菌PG—7去除膽固醇和抗氧化能力的研究

摘要：從糖蒜中篩選分離到的一株具有降膽固醇和抗氧化能力的產(chǎn)乳酸菌株P(guān)G-7，該菌對(duì)膽固醇的去除率為581%，對(duì)DPPH自由基和超氧自由基的清除率分別為917%和162%。克隆了PG-7的16S rDNA序列，并以其同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建了相關(guān)屬種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，該菌16S rDNA序列全長(zhǎng)1 638 bp，BLAST顯示該菌株與乳桿菌屬同源；PG-7菌株在進(jìn)化關(guān)系上與布氏乳桿菌屬（Lactobacillus buchneri）聚成一族。將其鑒定為布氏乳桿菌屬，命名為：Lactobacillus buchneri PG-7。

關(guān)鍵詞：乳酸菌；膽固醇；抗氧化；系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）01-0100-04

傳統(tǒng)發(fā)酵食品已成為現(xiàn)代生活重要的健康食品。乳酸菌是發(fā)酵食品的最主要菌群，發(fā)酵食品的功能與乳酸菌密切相關(guān)。乳酸菌也是最重要的益生菌資源，國(guó)內(nèi)外研究表明乳酸菌益生菌菌株具有抗氧化能力和去除膽固醇能力，乳酸菌等益生菌延緩衰老的機(jī)制主要是通過(guò)改善腸道微生態(tài)平衡、清除內(nèi)自由基實(shí)現(xiàn)的[1～6]。張?zhí)觳┑龋?007）[7]評(píng)價(jià)了52株乳酸菌的抗氧化能力，并對(duì)其中3株具有較強(qiáng)清除DPPH自由基能力的菌株進(jìn)行了羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力研究，結(jié)果表明，同一菌株對(duì)不同種類(lèi)自由基清除能力不同，乳酸菌的細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)自由基的清除能力亦不同。張江巍等（2005）[8]進(jìn)行了30株乳酸菌清除DPPH自由基和抗亞油酸過(guò)氧化能力的實(shí)驗(yàn)，從中篩選出兩株抗氧化活性較強(qiáng)的乳酸菌株，并研究了其無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)Fe2+螯合能力、超氧自由基和羥基自由基清除能力和菌株SOD活性。糖蒜作為我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，腌制期間的乳酸菌功能對(duì)糖蒜的風(fēng)味和功能具有重要影響，但有關(guān)這方面的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)研究了分離于市售糖蒜的一株產(chǎn)乳酸細(xì)菌的體外膽固醇去除能力及抗氧化能力，并進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，為研究健康食品的作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。

1材料與方法

11供試材料

菌株P(guān)G-2、PG-4、PG-7和PG-8從市售糖蒜分離得到，革蘭氏陽(yáng)性，產(chǎn)乳酸，本實(shí)驗(yàn)室保存。

12菌體及無(wú)細(xì)胞提取物的制備

保藏菌種經(jīng)過(guò)傳代活化后，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)18 h，3 000 r/min，離心15 min，收集菌體。離心后的菌體用pH值為74的磷酸緩沖溶液（PBS）洗滌3次，重新懸浮于磷酸緩沖溶液中，調(diào)整菌數(shù)至109 cfu/ml，用作菌體實(shí)驗(yàn)用。將109 cfu/ml菌體液超聲波冰浴破碎，細(xì)胞殘骸于10 000 r/min離心10 min，上清液即為無(wú)細(xì)胞提取物。

13膽固醇去除測(cè)定

參照Brashears等（1998）[9]的方法，并略有改進(jìn)。樣品預(yù)處理：取2 ml培養(yǎng)液，5 000 r/min離心7 min。取1 ml上清于離心管中，加入9 ml無(wú)水乙醇，振蕩處理5 min，10 000 r/min離心10 min。取2 ml上清加入2 ml P-Fe-S試劑，冰浴混勻反應(yīng)30 min。測(cè)OD550。試驗(yàn)菌種活化后接種于MRS培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，作為種子液。將種子液接種于含5%蛋黃液的MRS培養(yǎng)基中，每瓶取2 ml用來(lái)測(cè)定初始培養(yǎng)基中膽固醇含量，37℃培養(yǎng)24 h后再次測(cè)定培養(yǎng)基中膽固醇含量，計(jì)算膽固醇去除率。

14二苯代苦味?；―PPH）自由基測(cè)定

DPPH 溶于無(wú)水乙醇，反應(yīng)時(shí)1 ml提取液加1 ml濃度為02 mmol/L的DPPH，室溫下靜置30 min后，在517 nm處測(cè)吸光度變化[7]。

DPPH·的清除率（%）=[1- （A1-A2）/A3]×100

式中：A1表示未加樣品的DPPH 溶液的原始吸光度；A2表示樣品在測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)的本身吸光度；A3表示加樣后DPPH溶液的吸光度。

15超氧陰離子自由基（O-·2）測(cè)定

反應(yīng)體系包括濃度為150 mmol/L的Tris-HCl（pH82）、濃度為3 mmol/L的二乙三胺五乙酸、濃度為12 mmol/L鄰苯三酚和05 ml樣品，總反應(yīng)體積為35 ml。25℃恒溫水浴反應(yīng)10 min，測(cè)OD325[8]。

O-·2清除率（%）=〔1-（A11-A10）/（A01-A00）〕×100

式中： A00為不含樣品和鄰苯三酚；A01為不含樣品，含鄰苯三酚；A10為含樣品，不含鄰苯三酚；A11為含樣品和鄰苯三酚。

1616S rDNA基因的克隆、測(cè)序

菌株基因組DNA的提取參照《精編分子生物學(xué)指南》[10]的方法，略有改動(dòng)。擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA通用引物：上游P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游P2：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACT-3′。以菌株基因組為模板，P1、P2為引物，PCR擴(kuò)增16S rDNA。

PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5 min；94℃ 40 s， 55℃ 40 s， 72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠回收后克隆至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α，藍(lán)白斑篩選，挑白色菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切、PCR鑒定。正確的陽(yáng)性克隆測(cè)序（北京博尚生物公司）。

17系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將菌株16S rDNA序列在NCBI上與GenBank里的已知核酸序列進(jìn)行Blast分析。對(duì)比同源性較高的已知菌株16S rDNA基因序列，ClustalX183[11]進(jìn)行多序列比對(duì)，采用Neighbour-Joining[12]方法，通過(guò)Mega30軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值（bootstrap value）分析，以評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

2結(jié)果與分析

21膽固醇的去除作用

人體內(nèi)膽固醇的來(lái)源主要有兩種，一是內(nèi)源合成，二是外源攝取。針對(duì)內(nèi)源合成，一般通過(guò)篩選能夠抑制膽固醇合成限速酶HMG-CoA的物質(zhì)來(lái)尋找降膽固醇的功能性物質(zhì)。針對(duì)外源攝取，目前多是通過(guò)吸附吸收膽固醇來(lái)達(dá)到降膽固醇的目的。本研究的模型就是針對(duì)外源攝取而設(shè)計(jì)的。結(jié)果表明，不同株菌對(duì)膽固醇脫除作用差異較大，菌株P(guān)G-2、PG-4、PG-7和PG-8生長(zhǎng)期間對(duì)培養(yǎng)基中膽固醇去除率分別為215%、923%、581%和198%，其中PG-7對(duì)膽固醇去除作用效果最好。

22抗氧化作用

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能清除它，則表示受試物具有降低羥自由基、烷自由基或超氧自由基等自由基的有效濃度。超氧陰離子自由基（O-·2）是第一氧自由基，可以通過(guò)一系列反應(yīng)生成其它氧自由基，具有重要的生物功能，并且與多種疾病密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，4個(gè)菌株發(fā)酵液上清對(duì)DPPH·均具有很強(qiáng)的清除能力，PG-7菌株無(wú)細(xì)胞提取物清除DPPH·的能力最強(qiáng)，清除率為704%，其次是菌株P(guān)G-4，清除率為435%，菌株P(guān)G-2和PG-8的清除能力較低。菌株對(duì)O-·2的清除作用明顯低于DPPH·，而且發(fā)酵液上清的清除能力高于無(wú)細(xì)胞提取物，菌株P(guān)G-7的清除能力明顯高于其它菌株（表1）。本研究顯示，發(fā)酵液上清的清除能力明顯高于無(wú)細(xì)胞提取物，表明乳酸菌生長(zhǎng)期間的代謝產(chǎn)物對(duì)清除自由基具有重要作用。

23 PG-7菌株16S rDNA序列的PCR擴(kuò)增和測(cè)序

以提取菌株P(guān)G-7總DNA為模板，以細(xì)菌16S rDNA通用引物P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到約1 500 bp左右的特異性條帶，與預(yù)期相符（圖1）。

PCR產(chǎn)物回收純化后，連接PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α。提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRⅠ 和HindⅢ雙酶切鑒定。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切得到兩條片段，分別為載體片段（約2 700 bp）和目的片段（約為1 500 bp）（圖2A），與預(yù)計(jì)相符。進(jìn)一步以轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR鑒定。電泳檢測(cè)顯示，PCR擴(kuò)增出一條與目的基因一樣大小的特異性條帶，約為1 500 bp（圖2B）。結(jié)果表明，重組克隆質(zhì)粒PMD19-16S構(gòu)建成功。鑒定成功的陽(yáng)性克隆，送往北京博尚生物公司進(jìn)行序列測(cè)定。

24系統(tǒng)發(fā)育分析

PG-7菌株16S rDNA序列PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果表明，其16S rDNA基因全長(zhǎng)1 638 bp。利用NCBI的BLAST進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果表明該菌屬于乳酸桿菌屬細(xì)菌。根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果，調(diào)出相關(guān)性最高的序列和乳酸桿菌菌屬內(nèi)相關(guān)菌株的16S rDNA，利用ClustalX183進(jìn)行多序列比對(duì)，采用Neighbour-Joining方法，通過(guò)Mega30軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明，PG-7菌與布氏乳桿菌聚在一群，其同源性均在98%～99%之間。將其鑒定為L(zhǎng)actobacillus buchneri PG-7。

3討論

乳酸菌去除膽固醇和抗氧化能力是其保健功能的重要指標(biāo)。研究表明，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品糖蒜中分離的乳酸菌體外去除膽固醇和抗氧化能力較強(qiáng)，菌株P(guān)G-7對(duì)培養(yǎng)基中膽固醇的清除率為581%，發(fā)酵液上清對(duì)DPPH·和O-·2的清除率分別為917%和162%，發(fā)酵液上清比無(wú)細(xì)胞提取物對(duì)自由基的清除能力更強(qiáng)。崔志文等（2011）[13]發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌上清液具有較強(qiáng)的抗氧化能力。吳祖芳等（2010）[14]也曾報(bào)道菌懸液清除超氧陰離子自由基的能力高于無(wú)細(xì)胞提取物，并且通過(guò)對(duì)戊糖乳桿菌和植物乳桿菌的菌懸液及無(wú)細(xì)胞提取物抗氧化能力比較推測(cè)，乳酸菌的抗氧化能力與菌體表面的某些成分及細(xì)胞本身抗氧化機(jī)制有關(guān)。對(duì)PG-7的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析表明，其屬于布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）。國(guó)內(nèi)外有關(guān)于L buchneri 產(chǎn)細(xì)菌素[15]和青貯飼料發(fā)酵和需氧穩(wěn)定性[16]等方面的研究，對(duì)于布氏乳桿菌去除膽固醇和抗氧化能力的報(bào)道較少。本研究對(duì)于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的功能開(kāi)發(fā)，特別是布氏乳桿菌益生保健功能研究具有重要價(jià)值。后續(xù)的工作將開(kāi)展Lactobacillus buchneri PG-7的代謝及調(diào)控機(jī)制研究，為菌株功能開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)：

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