高壓靜電場對金針菇原生質(zhì)體再生的影響

摘要：以白金1號為試材，研究了高壓靜電場對金針菇原生質(zhì)體再生的影響。結(jié)果表明，經(jīng)1 000 kV/m高壓靜電場處理金針菇原生質(zhì)體（3904×107個/ml）20 min，可提高原生質(zhì)體的再生率。

關(guān)鍵詞：高壓靜電場；原生質(zhì)體；再生

中圖分類號：S646.1+5文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0084-03

近年來，靜電場的生物學(xué)效應(yīng)問題越來越受到重視，國內(nèi)外學(xué)者做了大量的研究。在宏觀方面，很多實驗結(jié)果都證明靜電場對生物體，尤其對一些農(nóng)作物有明顯的作用效應(yīng)，但劑量不同，生物效應(yīng)不同。在微觀方面，不少學(xué)者從不同的角度對其作用機理作了初步探討，但多集中在蔬菜、作物等種子處理上，在食用菌上的應(yīng)用研究較少[1，2]。

金針菇是我國最早進(jìn)行人工栽培的食用菌之一，其肉質(zhì)脆嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，深受人們喜愛。通過改進(jìn)培養(yǎng)基、栽培工藝、出菇管理條件等，金針菇的產(chǎn)量得到提高。但隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴大，尤其是工廠化、周年化栽培模式的出現(xiàn)，對優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)菌種的需求越來越迫切，而傳統(tǒng)育種手段周期長、成本高，制約著金針菇新品種的育成[3]。

20世紀(jì)60年代出現(xiàn)了原生質(zhì)體融合技術(shù)，通過脫壁后不同遺傳類型的原生質(zhì)體在融合劑的誘導(dǎo)下融合，最終達(dá)到部分或整套基因組的交換和重組，產(chǎn)生新的品種和類型。與傳統(tǒng)雜交育種相比，原生質(zhì)體融合可以使遠(yuǎn)緣雜交成為可能，遺傳物質(zhì)亦可進(jìn)行較完整的交換，且參與融合的親本數(shù)不局限于2個。

目前應(yīng)用原生質(zhì)體技術(shù)進(jìn)行食用菌育種已有報道：任軒等以杏鮑菇和平菇為親本菌株，采用雙親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育出高漆酶活性且遺傳穩(wěn)定的融合菌株[4]；李艷紅等利用原生質(zhì)體紫外誘變進(jìn)行了猴頭菌新菌種的研究[5]，但尚未見利用高壓靜電場對金針菇原生質(zhì)進(jìn)行處理的研究報道。本試驗研究了高壓靜電場對金針菇原生質(zhì)體的影響，以便為金針菇原生質(zhì)體融合育種提供技術(shù)支持。

1材料與方法

11供試菌株

金白1號（本所保存）。

12培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基（PDL）：馬鈴薯200 g，MgSO4 05 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 05 g，水1 L。

原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基（RM ）：馬鈴薯 200 g，酵母膏 20 g，蛋白胨20 g，蔗糖 20 g，MgSO4 15 g，甘露醇 10932 g，瓊脂20 g，水1 L，pH 50～60。

13試劑

高滲穩(wěn)定劑（等滲液）：06 mol/L 甘露醇；溶壁酶（lywallzyme，廣東省科學(xué)院微生物研究所）；無菌蒸餾水。

14儀器及其他用具

滅菌備用器具：1 ml、200 μl 槍頭，5 ml 注射器（內(nèi)塞脫脂棉），三角瓶，燒杯，濾紙，5 ml離心管。

其他：1 ml 、200 μl移液槍，接種針，涂布棒，鑷子，28℃ 水浴鍋，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，靜電場發(fā)生設(shè)備，游標(biāo)卡尺等。

15試驗方法

151溶壁酶的配制 稱取015 g溶壁酶， 加入無菌06 mol/L甘露醇10 ml，再用022 μm細(xì)菌濾膜過濾于50 ml 三角瓶中，制成15%的溶壁酶液。

152原生質(zhì)體的制備將供試菌株接種于裝有PDL 培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)5～7 d。將培養(yǎng)好的液體培養(yǎng)物倒入離心管，用無菌水洗滌2～3次，再用06 mol/L 甘露醇洗滌2～3次， 將菌絲體上的水用無菌濾紙吸干后，分成小塊，裝入5 ml無菌離心管。

按250 g菌絲體需2 ml 酶液的量加入15%溶壁酶液，28℃水浴脫壁3 h，間歇30 min振蕩一次。將酶裂解液倒入5 ml注射器管中（內(nèi)加脫脂棉），過濾于另一干燥離心管，離心后洗滌2～3次，最后加06 mol/L的甘露醇 2～3 ml懸浮，制得原生質(zhì)體原液。 用06 mol/L甘露醇將原生質(zhì)體原液梯度稀釋，制得原生質(zhì)體10、100倍稀釋液。

153原生質(zhì)體的高壓靜電場處理及再生將原生質(zhì)體原液及其10倍、100倍稀釋液按高壓靜電場處理條件分組，分別取100 μl均勻涂布于再生平板上。

高壓靜電場處理：按靜電場強度500、750、1 000 kV/m分3個處理組，空白對照（不處理）1組，每組3個重復(fù)，處理20 min。

原生質(zhì)體再生：各處理組經(jīng)高壓靜電處理后與對照組一起置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至第6天統(tǒng)計菌落數(shù)，計算原生質(zhì)體再生率。

再生率（%）=再生菌落數(shù)/原生質(zhì)體數(shù)×100

2結(jié)果與分析

21原生質(zhì)體鏡檢計數(shù)結(jié)果

對原生質(zhì)體10倍稀釋液進(jìn)行鏡檢計數(shù)，結(jié)果見表1。

22不同靜電場處理對金針菇原生質(zhì)體再生的影響

由表2可以看出，不同處理組合對金針菇原生質(zhì)體的再生率影響不同，以10倍稀釋液、1 000 kV/m處理20 min效果較好，再生率可達(dá) 00124%，其它處理與對照差異不大。原生質(zhì)體濃度對試驗結(jié)果影響較大，以10倍稀釋液（3904×107個/ml）較好，原液濃度過高計數(shù)、分離困難，100倍稀釋液則濃度過低，原生質(zhì)體基本不能再生。

自然界中的一切物體都處于靜電場的作用之下，靜電場對生物體的生命活動具有重要的影響，環(huán)境電場的變化，特別是外加的高壓靜電場，會對生物體的電荷分布、排列、運動發(fā)生改變，從而影響生物體的方方面面。

目前的研究認(rèn)為靜電場主要通過以下幾方面發(fā)揮作用：一是改變酶的活性。高壓靜電場能夠直接作用于酶，使得酶的活力和構(gòu)象發(fā)生變化，合適的高壓靜電場能夠使酶的活力增高，而過高的高壓靜電場能使酶的活力降低。高壓靜電場對酶的作用基本上是可逆的，經(jīng)高壓靜電場處理的酶穩(wěn)定性增加[6，7]。二是改變細(xì)胞膜的通透性。靜電場產(chǎn)生的電位差能促進(jìn)ATP的合成，觸發(fā)酶類的活化，使細(xì)胞內(nèi)外通透性增加，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，產(chǎn)生生物效應(yīng)和增產(chǎn)效果[8，9]。三是影響遺傳物質(zhì)。一定強度的靜電場能夠縮短細(xì)胞有絲分裂周期，提高細(xì)胞分裂速度，產(chǎn)生植物細(xì)胞的多核現(xiàn)象，引起植物細(xì)胞的染色體畸變[10]。

本試驗表明，利用1 000 kV/m高壓靜電場處理金針菇原生質(zhì)體20 min，可提高金針菇原生質(zhì)體的再生率。至于高壓靜電場是否影響金針菇原生質(zhì)體的遺傳物質(zhì)，經(jīng)高壓靜電場處理后的再生體農(nóng)藝性狀是否改變，還需進(jìn)一步驗證。

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