利用回交轉(zhuǎn)育培育黃淮稻區(qū)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻新品系

摘要：利用黃淮稻區(qū)主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮(zhèn)稻88為受體親本，選擇以秈稻明恢63為背景的轉(zhuǎn)基因抗蟲材料TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）和以粳稻中花11為背景的轉(zhuǎn)基因抗蟲材料RJ- 5（cry1C）為供體，分別進(jìn)行雜交和多代回交。每一世代后代單株，通過涂抹Basta抗性篩選，結(jié)合PCR鑒定跟蹤抗蟲目的基因以及田間抗蟲性鑒定、農(nóng)藝性狀選擇，培育出來源于TT51帶有cry1Ab/1Ac基因的抗蟲穩(wěn)定株系3個(gè)，來源于T2A-1帶有cry2A基因的穩(wěn)定株系2個(gè)，來源于T1C-19帶有cry1C基因的穩(wěn)定株系3個(gè)，來源于RJ- 5帶有cry1C基因的抗蟲穩(wěn)定株系2個(gè)。這些株系于田間均表現(xiàn)出很好的抗蟲性狀和優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)性狀，為黃淮稻區(qū)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻；回交轉(zhuǎn)育； Basta；PCR檢測(cè)；抗蟲性鑒定

中圖分類號(hào)：S511.035.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）01-0038-04

水稻是最主要的糧食作物，世界上超過一半人口以其為主食。鱗翅目害蟲一直是水稻的最大威脅之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年由于蟲害造成的損失達(dá)數(shù)億美元[1]。

由于水稻本身尚未發(fā)現(xiàn)有效的抗蟲基因，傳統(tǒng)育種面臨很多困難。目前，Bt毒蛋白基因是使用最廣泛的基因，用轉(zhuǎn)基因的方法將Bt毒蛋白基因?qū)氤Ｒ?guī)水稻，可使水稻對(duì)螟蟲的抗性提高[2]。轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因在自交T1代群體中一般遵循孟德爾分離規(guī)律，在轉(zhuǎn)基因植株與常規(guī)品種的雜交后代中，也能以單顯性基因方式遺傳[3，4]。因此可以通過對(duì)轉(zhuǎn)基因株系與主栽品種進(jìn)行多次回交轉(zhuǎn)育和選擇，使輪回親本基因頻率逐漸增加，從而獲得具有良好抗蟲性和優(yōu)質(zhì)豐產(chǎn)性狀的改良新品種[6，7]。

本課題組利用已獲得的三個(gè)以秈稻明恢63為遺傳背景的抗蟲轉(zhuǎn)基因株系和一個(gè)以粳稻中花11為背景的抗蟲轉(zhuǎn)基因材料分別與黃淮稻區(qū)主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮(zhèn)稻88進(jìn)行雜交和回交，利用抗蟲基因cry2A和cry1C與Bar基因緊密連鎖的關(guān)系[5]，對(duì)其雜交和回交后代進(jìn)行了Basta涂抹篩選，結(jié)合PCR鑒定跟蹤抗蟲目的基因、田間抗蟲鑒定、農(nóng)藝性狀選擇，育出了農(nóng)藝性狀優(yōu)良的抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻新品系。

1材料與方法

11親本材料

以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供的單拷貝轉(zhuǎn)Bt基因水稻株系 TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）、RJ-5（cry1C）為父本，以黃淮稻區(qū)主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮(zhèn)稻88為母本分別進(jìn)行雜交與回交，獲得F1、BC1F1、 BC2F1、BC3F1、BC3F2等世代。

12雜交及回交轉(zhuǎn)育

在8月中下旬，選取正處于開花期的稻穗，以黃淮稻區(qū)主栽品種為母本，46℃溫水去雄，以轉(zhuǎn)Bt基因水稻株系為父本分別進(jìn)行雜交獲得F1代，再以黃淮稻區(qū)主栽品種為輪回親本，連續(xù)回交獲得BC1F1、BC2F1、BC3F1等世代以及自交后代BC3F2。在開花前對(duì)每一個(gè)雜交或回交后代單株均進(jìn)行除草劑Basta抗性檢測(cè)和PCR分子檢測(cè)跟蹤抗蟲基因，結(jié)合田間篩選，從中選擇與親本外觀形狀相似的轉(zhuǎn)基因陽性植株再與輪回親本連續(xù)回交，或自交純合。

13Basta抗性選擇

待轉(zhuǎn)基因水稻長至20 cm左右時(shí)，進(jìn)行除草劑Basta（有效成分PPT）抗性檢測(cè)，PPT濃度為1 g/L，用棉簽雙面浸蘸然后涂在植株的葉片上，3～5 d后統(tǒng)計(jì)抗性株數(shù)及敏感株數(shù)。

14PCR分子檢測(cè)

選取Basta檢測(cè)陽性植株，摘取幼嫩葉片，充分研磨，利用TPS法[8]提取DNA，備用。根據(jù)三個(gè)抗蟲基因序列設(shè)計(jì)三對(duì)特異PCR引物，25 μl反應(yīng)體系，94℃預(yù)熱5 min，35個(gè)循環(huán)（94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min），72℃延伸5 min[9]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離和EB染色后在紫外透射儀下觀察。

15轉(zhuǎn)基因植株的田間抗蟲鑒定

在不用任何藥劑防治螟蟲的情況下，于螟蟲高發(fā)期田間調(diào)查稻縱卷葉螟危害情況及其引起的白穗發(fā)生情況，統(tǒng)計(jì)白穗率。

16田間種植及農(nóng)藝性狀考察

在濟(jì)南飲馬泉試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)種植轉(zhuǎn)基因水稻，小區(qū)面積為667 m2，重復(fù)2次，同時(shí)種植主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮(zhèn)稻88為對(duì)照。田間管理同大田，但不施用任何農(nóng)藥防蟲防病?？疾斓霓r(nóng)藝性狀有生育期、株高、穗長、穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量等。

2結(jié)果與分析

21轉(zhuǎn)育經(jīng)過

2009年配制雜交組合TT51 （cry1Ab/1Ac）/圣稻13、TT51 （cry1Ab/1Ac）/圣稻15、TT51 （cry1Ab/1Ac）/鎮(zhèn)稻88、T2A-1（cry2A）/圣稻13、T2A-1（cry2A）/圣稻15、T2A-1（cry2A）/鎮(zhèn)稻88、T1C-19（cry1C）/圣稻13、T1C-19（cry1C）/圣稻15、T1C-19（cry1C）/鎮(zhèn)稻88、RJ-5（cry1C）/圣稻13、RJ-5（cry1C）/圣稻15、RJ-5（cry1C）/鎮(zhèn)稻88。2010年分別以圣稻13、圣稻15、鎮(zhèn)稻88為輪回親本進(jìn)行回交，獲得BC1F1，同年海南南繁獲得BC2F1，2011年獲得BC3F1，2012年自交獲得BC3F2。

22Bt轉(zhuǎn)基因植株除草劑抗性鑒定

對(duì)雜交和回交后代單株進(jìn)行除草劑Basta抗性鑒定。PPT濃度為1 g/L[10]，單面涂抹葉片，3～4 d調(diào)查，結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)Bt基因且?guī)в蠦ar基因標(biāo)記的T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）、RJ-5（cry1C）株系與黃淮海主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮(zhèn)稻88的雜交后代F1分離群體中Basta的陰陽性分離比例按照1∶1分離，由此表明三個(gè)外源基因均為單顯性基因且遵循孟德爾分離規(guī)律。

23Bt轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)

由于TT51 （cry1Ab/1Ac） 轉(zhuǎn)基因株系無Bar基因標(biāo)記，所以需對(duì)所有以TT51 （cry1Ab/1Ac）轉(zhuǎn)基因株系為父本的雜交和回交后代單株進(jìn)行PCR分子檢測(cè)跟蹤Bt基因，對(duì)其他三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為父本的雜交及回交后代選取Basta檢測(cè)為陽性的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，選取陽性植株。檢測(cè)顯示Basta檢測(cè)陽性的植株P(guān)CR分子檢測(cè)均為陽性，表明了Bar基因和目的基因cry2A和cry1C是協(xié)同表達(dá)的。部分陽性植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果見圖1、圖2、圖3。

24Bt轉(zhuǎn)基因植株的田間抗蟲性鑒定

田間種植觀察TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）及RJ-5（cry1C）轉(zhuǎn)基因株系與黃淮稻區(qū)主栽品種圣稻13、圣稻15、鎮(zhèn)稻88分別雜交的后代F1和回交世代BC1F1、BC2F1、BC3F1及BC3F2代材料。插秧時(shí)分單株插栽，涂抹Basta 5 d后根據(jù)Basta抗性表現(xiàn)，掛牌標(biāo)記陰陽性植株，見圖4。田間自插秧到收獲未施任何農(nóng)藥。在稻縱卷葉螟大發(fā)生時(shí)期，轉(zhuǎn)基因水稻幾乎沒有受到卷葉螟的危害，而對(duì)照和非轉(zhuǎn)基因水稻卷葉螟危害嚴(yán)重，黃淮稻區(qū)品種圣稻13、圣稻15和鎮(zhèn)稻88白穗率（死亡率）達(dá)到50%，而轉(zhuǎn)基因水稻新品系白穗率相當(dāng)?shù)停∮?1%，如圖5。田間調(diào)查白穗率發(fā)生情況，結(jié)果如表1。

25回交和自交后代的田間農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量表現(xiàn)

回交轉(zhuǎn)育的目的是為育出轉(zhuǎn)基因水稻新品系，所以在對(duì)抗性選育的同時(shí)，更注重了對(duì)產(chǎn)量、品質(zhì)等綜合性狀的選育。對(duì)獲得的3個(gè)源于TT51帶有cry1Ab/1Ac基因的抗蟲穩(wěn)定株系，2個(gè)來源于T2A-1帶有cry2A基因的穩(wěn)定株系，3個(gè)來源于T1C-19帶有cry1C基因的穩(wěn)定株系，2個(gè)來源于RJ-5帶有cry1C基因的抗蟲穩(wěn)定株系，2012年在濟(jì)南飲馬泉試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)按小區(qū)種植，每小區(qū)面積為667 m2，同時(shí)種植主栽品種圣稻13、圣稻15和鎮(zhèn)稻88 為對(duì)照。田間管理同大田，但不施用任何農(nóng)藥防蟲防病?？疾斓霓r(nóng)藝性狀有生育期、株高、穗長、穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量等。通過回交轉(zhuǎn)育培育出的轉(zhuǎn)基因水稻新品系主要農(nóng)藝性狀田間表現(xiàn)如表2所示。

3結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)基因水稻成功運(yùn)用取決于外源基因在植物體中能否保持遺傳的穩(wěn)定性[11，12]。在水稻抗蟲育種方面，國內(nèi)外相繼有不少獲得抗蟲轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道[13，14]。但由于轉(zhuǎn)化過程中諸多因素的影響，有些水稻品種很難轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化率很低[15，16]；有些雖獲得部分轉(zhuǎn)基因植株，但因轉(zhuǎn)基因植株農(nóng)藝性狀不佳，難以直接應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[17，18]。本研究將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，采用雜交、回交等方法將抗蟲基因轉(zhuǎn)入栽培品種中，為充分利用已獲得的抗性轉(zhuǎn)基因材料提供了廣闊的前景。本研究結(jié)果顯示，cry1Ab/1Ac、cry2A、cry1C基因及其介導(dǎo)的抗性在所有回交獲得的轉(zhuǎn)基因株系中均能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，回交轉(zhuǎn)基因株系同樣表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗蟲能力。利用回交轉(zhuǎn)育技術(shù)，已獲得多個(gè)優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)且抗性穩(wěn)定的水稻新品系。本試驗(yàn)中由于粳稻和秈稻品種雜交其后代的抽穗期很晚，不易收獲，故采用遮光處理方法并有效解決了抽穗期晚的問題。參考文獻(xiàn)：

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