血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和雌二醇促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞分化生成血管的對(duì)比研究

[摘要]目的：對(duì)比研究常規(guī)劑量下血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和雌二醇對(duì)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）分化生成血管的促進(jìn)作用。方法：分離培養(yǎng)人外周血EPCs，與基質(zhì)膠混勻后注射到9只裸鼠雙側(cè)下腹部，另設(shè)2只注射等體積培養(yǎng)液與基質(zhì)膠的混合液。將9只注射細(xì)胞的裸鼠隨機(jī)分為3組，每組分別定期局部注射VEGF、雌二醇，生理鹽水，定期觀察記錄血管組織塊的生長(zhǎng)狀況。移植6周后取材，測(cè)量計(jì)算血管組織塊的體積、HE染色觀察血管組織塊的血管增殖狀況，各組之間進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果：給藥組血管組織塊體積與注射生理鹽水組相比，具有顯著性差異，體積明顯偏大，而給藥組之間體積未見(jiàn)顯著性差異。HE染色觀察可見(jiàn)各組的血管組織塊內(nèi)血管增殖明顯，血管排列紊亂的，管腔大小不一。給藥組血管密度明顯大于注射生理鹽水組，而給藥組之間的血管密度差異較小。結(jié)論：VEGF和雌二醇組具有促進(jìn)EPCs分裂增殖形成血管的能力，常規(guī)劑量下兩者促進(jìn)EPCs分裂增殖生成血管的能力無(wú)顯著性差異。

[關(guān)鍵詞]內(nèi)皮祖細(xì)胞；血管；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；雌二醇。

[中圖分類號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）01-0048-03

Comparative study of vascular endothelial growth factor and estradiol in promoting endothelial progenitor cells differentiation and generation blood vessels

DONG Yong，LI Wen-zhi，XIN Yi，SUN Zhi

（Department of Plastic Surgery and Laser Medicine，Beijing Anzhen Hospital of Capital Medical University Beijing Institute of Cardiopulmonary and Vascular Disease，Beijing 100029，China）

Abstract： Objective To compare the ability of vascular endothelial growth factor （VEGF） and estradiol in promoting endothelial progenitor cells differentiation and generation blood vessels under common doses. Methods To isolate and culture human peripheral blood EPCs first， then to mixe with the matrigel and transplante to the lower abdomens of nine nude mice，to divide the nine nude mice into three groups according to a random grouping， to inject VEGF，estradiol and saline at a regular time，to observe and record the growing status of vascular tissue regularly，to draw the vascular tissue after six weeks，to observe the organizational structure by HE staining， then contrast with the groups. Results The vascular tissue volume groups injected of drugs have significant difference with the groups injected of saline，they have bigger volume to contrast the groups injected of saline， but he vascular tissue volume between the groups injected of drugs is no significant difference. By drawning HE staining， the vascular tissues have proliferational mussy blood vessels，The vascular density of the groups injected of drugs is significantly greater than the groups injected of saline， but he vascular density between the groups injected of drugs is small. Conclusion VEGF and estradiol can promote EPCs differentiation and generation blood vessels，their respective promoting EPCs differentiation and generation blood vessels potency is no significant difference under common doses.

Key words：endothelial progenitor cells； blood vessel；vascular endothelial growth factor；estradiol

血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，EPCs因參與血管的再內(nèi)皮化和血管新生，在心腦血管疾病治療及創(chuàng)傷修復(fù)等方面發(fā)揮著重要的作用，已經(jīng)有大量的研究通過(guò)移植EPCs治療缺血性和創(chuàng)傷性疾病，取得了很好的療效[1-3]。VEGF和雌二醇通過(guò)加強(qiáng)EPCs的遷移增殖和粘附，具有促進(jìn)血管生成的作用，但兩種藥物用于促進(jìn)EPCs分化生成血管的研究報(bào)道較少，而有關(guān)兩者在常規(guī)劑量下促進(jìn)血管生成效果方面的對(duì)比研究還未見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)移植EPCs至裸鼠，通過(guò)比較EPCs增殖生成血管組織塊的體積和血管組織塊內(nèi)血管的密度來(lái)比較兩種藥物的效果，為今后兩種的藥物的合理應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物：Balb/ca-nu裸鼠（購(gòu)自北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）。

1.1.2 主要試劑和儀器：EGM-2培養(yǎng)基 （Lonza公司），人淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破酚邢薰荆?，基質(zhì)膠（BD公司），雌二醇（Sigama公司），VEGF（Sigama公司），鼠抗人CD133單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），VEGFR-2（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），鼠抗人CD34單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Ⅷ因子（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），鼠兔通用型二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），多聚賴氨酸（Sigama公司），多聚甲醛（Sigama公司），濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），Olympus倒置顯微鏡（日本）。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定：每次采集健康人外周血25mL，肝素抗凝后用 磷酸鹽緩沖液（pbs）稀釋（1：1），稀釋后沿試管壁緩慢加入到人淋巴細(xì)胞分離液液面上（血液與Ficoll體積比為2：3），然后將其放到水平離心機(jī)內(nèi)以2000 r/min速度離心20 min。離心后液體從上到下被分為四層，依次為血漿層，單個(gè)核細(xì)胞層，淋巴細(xì)胞分離液層，紅細(xì)胞層。吸取單個(gè)核細(xì)胞層后加入等體積含有2%胎牛血清的pbs，以1000 r/min速度離心10min，棄上清液，離心兩遍，清洗兩遍。細(xì)胞培養(yǎng)至第7天后用PBS洗掉非貼壁細(xì)胞，留下的貼壁細(xì)胞用胰酶消化，消化完成后加完全培養(yǎng)基終止，吸取細(xì)胞液以1000r/min速度離心10min。將離心后的細(xì)胞加培養(yǎng)基混勻，然后滴加到培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞爬片上，讓細(xì)胞貼片30min后，在培養(yǎng)皿內(nèi)輕輕的添加完全培養(yǎng)液，放于溫度為370C、二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為5%和濕度≥95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞爬滿爬片。

1.2.2 移植血管內(nèi)皮祖細(xì)胞：取2～3代貼壁細(xì)胞用PBS洗滌2次，胰酶消化后濃集制成細(xì)胞懸液，使其密度為1×106/ml。選用Balb/ca-nu裸鼠11只，雌雄不限，鼠齡（30±3） 天，體重（18±2）g ，隨機(jī)選取9只裸鼠分為A、B、C三組，取細(xì)胞懸液與等量基質(zhì)膠混勻后植入裸鼠腹部雙側(cè)皮下組織內(nèi)，每處約0.5ml，共18處。每周給予A組VEGF 150ng/只、B組雌二醇0.1mg/只，C組生理鹽水0.5ml。剩余2只裸鼠僅注射0.5ml培養(yǎng)液與基質(zhì)膠的混合液。

1.2.3 培養(yǎng)組織的觀察：每周定期觀察記錄血管組織塊的生長(zhǎng)情況，測(cè)量血管組織塊長(zhǎng)徑a和短徑b，按公式v=ab2/2計(jì)算組織塊體積。移植后第六周時(shí)切取組織，用4%多聚甲醛固定，所有的樣本浸入石蠟，制成石蠟切片后作HE染色，對(duì)比觀察血管組織塊及周邊皮膚組織的光鏡結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

1周后觀察兩只僅注射培養(yǎng)液與基質(zhì)膠混合液的裸鼠發(fā)現(xiàn)注射部位凸起的腫塊變小，兩周后幾乎消失。9只注射細(xì)胞裸鼠的血管組織塊生長(zhǎng)迅速，體積明顯增大，外形呈球狀，觸之較軟（圖1）。六周后取材，對(duì)A組、B組與C組的血管組織塊體積分別進(jìn)行多樣本方差分析（表1），結(jié)果A組（0.61±0.05）cm3、B組（0.57±0.04）cm3與C組（0.3±0.01）cm3相比都具有顯著性差異，體積明顯偏大（圖2），A組與B組的體積對(duì)比未見(jiàn)顯著性差異。進(jìn)行HE染色觀察，注射細(xì)胞組裸鼠與僅注射培養(yǎng)液與基質(zhì)膠混合液的裸鼠相比，新生組織內(nèi)血管增殖明顯，許多藍(lán)染的血管內(nèi)皮細(xì)胞圍成管腔樣結(jié)構(gòu)，管腔排列紊亂，大小不一。A組和B組血管組織塊的血管密度與C組相比明顯偏大，而A組和B組之間的差異較?。▓D3）。

3 討論

血管新生是從先前存在的血管上出芽生成新生毛細(xì)血管的過(guò)程，人體組織的正常生長(zhǎng)均需要血管新生。血管發(fā)生指發(fā)生在胚胎發(fā)育時(shí)期的EPCs形成原始血管的過(guò)程。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，骨髓和循環(huán)外周血中也存在EPCs[4]，EPCs不僅參與血管發(fā)生，在缺血、創(chuàng)傷等因素下，骨髓EPCs還可定向遷移至缺血部位，增殖分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞參與血管新生。VEGF和雌二醇對(duì)EPCs的增殖、分化和遷移起著重要的調(diào)節(jié)作用，運(yùn)用其調(diào)節(jié)后，不但會(huì)促進(jìn)EPCs分化生成血管，而且勢(shì)必會(huì)減少EPCs的用量。盡管已有研究表明VEGF和雌二醇對(duì)EPCs的分化都起著較強(qiáng)的促進(jìn)作用，但是目前還未見(jiàn)有關(guān)兩者間效果比較的研究報(bào)道。

本研究利用EPCs分化增殖生成血管的特點(diǎn)，將相同劑量的EPCs移植到裸鼠皮下，定期注射常規(guī)劑量的VEGF（150ng）和雌二醇（0.1mg），通過(guò)血管組織塊的體積和血管組織塊內(nèi)血管密度來(lái)間接反映它們對(duì)EPCs分化生成血管的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示給藥組血管組織塊的體積與血管密度與單純注射鹽水組相比都明顯的偏大，提示VEGF和雌二醇對(duì)EPCs的分化具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，而常規(guī)劑量下VEGF和雌二醇促進(jìn)EPCs分化生成血管的作用卻無(wú)明顯的差異。

VEGF和雌二醇與EPCs的生物活性密切相關(guān)。VEGF又稱血管通透因子，是一種特異性的，與血管生長(zhǎng)有密切關(guān)系，并有促進(jìn)血管通透性作用的細(xì)胞因子。VEGF通過(guò)和內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，向細(xì)胞內(nèi)傳遞血管生成信號(hào)[5]，VEGF不僅能夠促進(jìn)EPCs的動(dòng)員、增殖[6]，并對(duì)EPCs具有趨化作用， 可促進(jìn)血管內(nèi)膜修復(fù)及缺血組織的血管新生[7]。雌二醇與血管系統(tǒng)的形成和功能密切相關(guān)[8]，雌二醇能增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和形成，雌二醇介導(dǎo)的內(nèi)皮功能的改善與其能夠促進(jìn)其前體EPCs的增殖、遷移與黏附[9]有很大的關(guān)系。研究表明雌二醇能通過(guò)內(nèi)皮型一氧化氮合酶相關(guān)的機(jī)制動(dòng)員骨髓來(lái)源的 EPCs到達(dá)外周血，促進(jìn)血管新生和內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過(guò)程[10]，此外，雌二醇還可以通過(guò)促進(jìn)端粒酶活性來(lái)抑制 EPCs 衰老，促進(jìn) EPCs 的分化[11-13]。

VEGF是目前最強(qiáng)效的促血管生成因子， 一般認(rèn)為，在常規(guī)劑量下，VEGF促進(jìn)EPCs分化生成血管的能力要強(qiáng)于雌二醇，但在研究中我們發(fā)現(xiàn)，兩者在注射給藥方式下促進(jìn)EPCs分裂增殖生成血管的能力卻無(wú)顯著性差異，這可能是由于VEGF生物半衰其短，直接注射給藥后，難以在體內(nèi)維持持續(xù)的有效濃度。雖然雌二醇的最大藥效與VEGF相比較弱，但其生物半衰期相對(duì)較長(zhǎng)，注射后有效藥物濃度維持時(shí)間也較長(zhǎng)，因此雌二醇的實(shí)際藥物效應(yīng)與VEGF相比未見(jiàn)顯著性差異。

在血管性疾病的研究中，VEGF常被用來(lái)促進(jìn)血管的生成，但VEGF提取困難，價(jià)格昂貴，而且通常采用的注射給藥方法很難實(shí)現(xiàn)藥效的合理發(fā)揮，因此若采用雌二醇來(lái)代替VEGF，在取得相同效果的同時(shí)，將會(huì)大大節(jié)約試驗(yàn)成本。

綜上所述，本研究率先對(duì)常規(guī)劑量下VEGF和雌二醇促進(jìn)EPCs分裂增殖生成血管的能力進(jìn)行了對(duì)比研究，該項(xiàng)研究不但驗(yàn)證了VEGF和雌二醇具有促進(jìn)EPCs分化生成血管的能力，而且結(jié)果提示兩者之間對(duì)EPCs分化生成血管的能力無(wú)顯著差異。這不但指正出了人們?cè)诶肰EGF時(shí)的誤區(qū)，而且該研究也為人們?cè)谘苄约膊⊙芯恐泻侠磉x取促血管生成藥物時(shí)提供了參考數(shù)據(jù)。

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