葡萄糖對人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響

[摘要]目的：以體外培養(yǎng)的人牙周膜成纖維細(xì)胞（HPDLF）為研究對象，觀察不同濃度的葡萄糖對HPDLF中骨保護(hù)素（OPG）、核因子κB受體活化劑配體（RANKL）mRNA表達(dá)的影響，探討葡萄糖在牙槽骨吸收中的作用。方法：組織塊法體外原代培養(yǎng)HPDLF并鑒定，選擇4～8代的HPDLF作為實驗的靶細(xì)胞，不同濃度的葡萄糖（0、5.5、11.1、16.7、22.2、33.3mmol/l）干預(yù)HPDLF ，半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測HPDLF中OPG、RANKL mRNA的表達(dá)。結(jié)果：高濃度的葡萄糖可下調(diào)HPDLF中OPG mRNA的表達(dá)，呈劑量依賴性；可上調(diào)RANKL mRNA的表達(dá)，也呈劑量依賴性，且使RANKL/OPG mRNA的比值隨著葡萄糖濃度的增高而呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢。結(jié)論：糖尿病時，牙周組織中高濃度的葡萄糖，可下調(diào)OPG 的表達(dá)，上調(diào)RANKL的表達(dá)，使RANKL/OPG 的比值升高，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化，刺激骨吸收，導(dǎo)致牙槽骨的破壞，加重牙周病的病情。

[關(guān)鍵詞]人牙周膜成纖維細(xì)胞；葡萄糖；骨保護(hù)素；核因子κB受體活化劑配體

[中圖分類號]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0071-04

The effects of high glucose on OPG and RANKL expression in human periodontal ligament fibroblasts

ZHANG Lan1，SUN Lin-lin2，DING Yan3，SONG Jian-ling2

（1.Department of Periodontics and Mucosal Diseases， Stomatological Hospitol of Xian Jiaotong University， Xi’an 710004，Shanxi，China；2. Stomatological Hospitol of Baoji；3. Department of oral medicine，Wuxi Mental Health Center）

Abstract： Objective To observe the effects of different concentrations of glucose on mRNA expression of osteoprotegerin （OPG） and receptor activator of NF-kappa B ligand （RANKL） in human periodontal ligament fibroblasts （HPDLF） and investigate the effects of glucose on alveolar bone absorption. Methods The primary HPDLF were cultured according to the method of tissue explant in vitro and identified by immunohistochemistry. HPDLF from passages four to eight were used for experiments. HPDLF were exposed respectively to different concentrations of glucose （0， 5.5， 11.1， 16.7，22.2， 33.3mmol/l）. The mRNA expression of OPG and RANKL in HPDLF was detected using semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） analysis. Results High concentrations glucose down-regulated mRNA levels of OPG and up-regulated the mRNA levels of RANKL dose-dependently. The ratio of RANKL mRNA to OPG mRNA also increased as the glucose concentration rose. Conclusion The high level glucose in periodontal tissue in diabetes mellitus could down-regulate OPG expression and up-regulated RANKL expression， increase the ratio of RANKL to OPG， activate the differentiation of osteoclasts and promote alveolar bone absorption， which might increase the susceptibility of diabetics to periodontal disease.

Key words：Human periodontal ligament fibroblasts；glucose；OPG ；RANKL

近年來對骨吸收機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)骨保護(hù)素（osteoprote gerin， OPG）及其配體核因子-κB受體活化劑配體（receptor activator of nuclear factor- κB ligand ，RANKL）是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、成熟和骨吸收功能的關(guān)鍵因子，在生理性、病理性骨吸收中發(fā)揮著重要作用。OPG和RANKL能在人牙周膜成纖維細(xì)胞（Human periodontal ligament fibroblasts，HPDLF）中表達(dá)， 大多數(shù)細(xì)胞因子和激素可通過改變HPDLF中OPG和RANKL的合成，間接調(diào)控破骨細(xì)胞的分化和成熟。

糖尿病是由胰島素分泌異常而引起的內(nèi)分泌代謝性疾病，高血糖是糖尿病最主要的特征，糖尿病可以引起全身性骨代謝紊亂，并導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥。臨床發(fā)現(xiàn)伴發(fā)有糖尿病的牙周病患者牙周病變嚴(yán)重、牙槽骨吸收迅速、預(yù)后較差。那么糖尿病時牙周骨吸收的變化與牙周病時有何不同呢？究竟葡萄糖水平的變化對牙周病的進(jìn)展及組織破壞程度有多大相關(guān)性呢？本實驗?zāi)M生理及病理條件下不同的葡萄糖濃度，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（semiquantitative reverse transcription polymerase chain reaction， RT-PCR）檢測葡萄糖干預(yù)HPDLF后，OPG、RANKL mRNA的表達(dá)量，探討機(jī)體在高糖狀態(tài)下牙周組織中OPG、RANKL的變化情況，了解糖尿病時牙槽骨吸收的可能機(jī)理，為糖尿病和糖尿病伴牙周病患者的牙周防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑：D-葡萄糖、胰蛋白酶、氨卞青霉素、硫酸鏈霉素（Sigama公司，美國），胎牛血清（灝陽公司，天津），RT-PCR試劑盒、Biozol、Bio Marker I （博日公司，杭州），低糖DMEM干粉（Gibco 公司，美國），SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒、波形蛋白單克隆抗體、角蛋白單克隆抗體 （博士德公司，武漢）。

1.2 人牙周膜成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定：本實驗采用司徒鎮(zhèn)強(qiáng)的組織塊法進(jìn)行HPDLF的原代培養(yǎng)[1]。選擇12～18歲因正畸治療需要拔除的健康前磨牙，取材前征得患者的同意，告知其用途。牙齒拔出后，立即置于含無菌D-Hanks液（氨卞青霉素200μg/ml，硫酸鏈霉素200μg/ml）的培養(yǎng)皿中，反復(fù)沖洗，用無菌手術(shù)刀片刮取牙根中1/3的牙周膜組織，用眼科剪剪碎，然后將含有組織塊的DMEM培養(yǎng)液移入15ml離心管中，1200r/min離心5min，棄去上清液，加入適量含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，吹打混勻，移入預(yù)先鋪好一層半干FBS的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中（5%CO2、37℃、飽和濕度），倒置培養(yǎng)4h后，向培養(yǎng)瓶中補(bǔ)加2ml含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。每2～3天更換含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液一次，原代培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁生長鋪滿瓶底約60%～80%時即可以傳代。取生長良好的第5代HPDLF，調(diào)整細(xì)胞密度為104個/ml接種到12孔培養(yǎng)板中央的蓋玻片上，待細(xì)胞融合達(dá)60%～70%，取出蓋玻片。HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)，免疫組化SP法進(jìn)行波形絲蛋白、角蛋白染色，光鏡下觀察可見細(xì)胞波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性。

1.3 實驗分組：取生長良好的第5代HPDLF，調(diào)整細(xì)胞密度為5.0×105個/ml，接種于6只25ml玻璃培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)液為含10%FBS的DMEM，待細(xì)胞充分貼壁并達(dá)80%匯合時，換用無血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。按照葡萄糖的實驗分組改用含不同濃度葡萄糖的DMEM培養(yǎng)液（對照組：0mmol/l、1組：5.5mmol/l、2組：11.1mmol/l、3組：16.7mmol/ l、4組：22.2mmol/l、5組：33.3mmol/l）干預(yù)6組HPDLF，干預(yù)時間為24h。

1.4 RT-PCR檢測

1.4.1總RNA的提取和鑒定：選用BIOZOL常規(guī)提取HPDLF的總RNA，在 1.5%瓊脂糖凝膠中電泳（恒壓80V，電泳緩沖液為1×TAE）30min后，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。取溶解后的總RNA，按照1∶20倍體積稀釋，5μl RNA+95μl RNase free H2O，在紫外分光光度計上分別讀取260 nm、280 nm的吸光度（OD）值?？俁NA的純度為：OD（260）/OD（280）?？俁NA純度的比值為1.8～2.0，說明所提取的HPDLF總RNA質(zhì)量較好。

1.4.2 引物的設(shè)計與合成：人OPG、RANKL、β-actin的引物經(jīng)Premier 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計，經(jīng)GeneBank檢索引物序列及位點，分析核實后，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成（見表1）。

1.4.3 反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)合成cDNA：操作在冰浴（4℃）下進(jìn)行，在PCR管加入5×RT Buffer2.0μl、dNTP Mixture （10mM） 1.0μl、Random Hexamer Primer0.5μl、RNase inhibitor （40U/μl） 0.5μl、AMV Reverse Transcriptase0.5μl、實驗樣品RNA2.5μl、RNase free H2O 3.0μl組成總體積10μl體系，瞬時離心數(shù)秒，置于PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)合成cDNA。反應(yīng)條件：25℃ 10min、50℃ 45min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）、95℃ 5min（滅活逆轉(zhuǎn)錄酶）、4℃ 5min。

1.4.4 PCR反應(yīng)：配制PCR反應(yīng)液：10×PCR Buffer （含Mg2+）2.5μl、dNTP Mixture （10mM） 0.5μl、上游特異性引物（5μM） 0.5 μl、下游特異性引物（5μM） 0.5μl、Taq mix DNA polymerase0.5μl、RT產(chǎn)物2.5μl、dd H2O 18μl，總體積25μl。進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性3min后開始循環(huán)，94℃變性30s→55或58℃退火30s→72℃延長1min，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72℃延伸5min。退火溫度：OPG 55℃；RANKL 58℃；β-actin 55℃。

1.4.5 瓊脂糖凝膠電泳：向PCR產(chǎn)物（25μl）中加入6×Loadding Buffer 5μl，振蕩器上混勻。按照順序加入Bio Maker Ι和PCR產(chǎn)物各5μl于凝膠孔中，電壓80V，電泳50min，置于紫外透射儀下，采用Dolphin-1D凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、分析各條帶光密度值。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用Spss13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以 x±s表示，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析，并對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較（LSD-t），P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人牙周膜成纖維細(xì)胞總RNA的檢測：實驗所提取的HPDLF總RNA，在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳結(jié)束后，凝膠成像系統(tǒng)觀察可見有兩條完整清晰的RNA電泳條帶，即28S和18S，且28S條帶的亮度和寬度約為18S條帶的兩倍，表明所提取的總RNA完整性很好。在紫外分光光度計分析，結(jié)果如下：總RNA OD（260）=1.43；總RNA OD（280）=0.72；總RNA純度：OD （260）/OD（280）≈2，說明總RNA質(zhì)量較好、純度較高。

2.2 葡萄糖對人牙周膜成纖維細(xì)胞OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響：OPG、RANKL、β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物分別為342 bp、442 bp、179 bp，見圖1。各組樣本OPG、RANKL目的基因條帶和β-actin參照基因條帶像素值之比為OPG、RANKL mRNA表達(dá)的相對含量，見表2。

2.2.1 葡萄糖濃度下調(diào)HPDLF中OPG mRNA的表達(dá)，呈濃度依賴性。5.5mmol/l濃度的葡萄糖對OPG mRNA表達(dá)的作用與對照組（0mmol/l）相比，無差異（P>0.05）。而11.1mmol/l的葡萄糖可下調(diào)OPG mRNA的表達(dá)（P<0.05），并在16.7mmol/l、22.2mmol/l、33.3mmol/l時隨著濃度的增加下調(diào)作用逐漸明顯，呈濃度依賴性（P<0.05）（見表2）。

2.2.2 葡萄糖濃度上調(diào)HPDLF中RANKL mRNA的表達(dá)，呈濃度依賴性。5.5mmol/l的葡萄糖對RANKL mRNA的表達(dá)的作用與對照組（0mmol/l）相比，無明顯差異（P>0.05）。而11.1mmol/l的葡萄糖可上調(diào)RANKL mRNA表達(dá)（P<0.05）， 在16.7mmol/l、22.2mmol/l、33.3mmol/l時隨著濃度的增加上調(diào)作用逐漸明顯，并呈濃度依賴性（見表2）。

2.2.3 RANKL/OPG mRNA比值的變化：RANKL/OPG mRNA的比值隨著葡萄糖濃度的增高而呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢。11.1mmol/l、16.7mmol/l、22.2mmol/l和33.3mmol/l的葡萄糖對RANKL/OPG mRNA比值的上調(diào)作用較對照組和5.5mmol/l的葡萄糖組均有顯著差異（P<0.05），且各組之間RANKL/OPG mRNA的比值均有顯著差異（P<0.05）（見表2）。

3 討論

牙周病和糖尿病是我國人群中的兩大常見病和多發(fā)病，近年來發(fā)病率一直呈上升趨勢，并且隨著年齡的增長嚴(yán)重程度也隨之加重。臨床研究表明，牙周病和糖尿病存在共同的危險因素、且相互影響互為高危因素。世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將牙周病列為糖尿病的第六并發(fā)癥。因而牙周病與糖尿病關(guān)系的研究倍受關(guān)注。

高血糖作為糖尿病最基本的生化特性，在糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。它可以提高破骨細(xì)胞的活性，加速骨吸收，引起骨代謝的紊亂，并導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥[2]。牙周組織的破壞，最終也以牙槽骨的骨質(zhì)喪失為結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)體內(nèi)葡萄糖水平與牙周病的進(jìn)展及組織破壞程度密切相關(guān)。

OPG是影響破骨細(xì)胞分化、成熟和調(diào)節(jié)骨代謝的關(guān)鍵因子，OPG的主要功能是抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟破骨細(xì)胞的骨吸收活性并誘導(dǎo)其凋亡。RANKL的主要作用為刺激破骨細(xì)胞的分化和活性，抑制破骨細(xì)胞的凋亡。RANKL是目前發(fā)現(xiàn)的惟一能直接誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化、發(fā)育并參與破骨細(xì)胞功能調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子。RANKL基因敲除的小鼠均出現(xiàn)異常的骨吸收，發(fā)生嚴(yán)重的骨質(zhì)硬化[3]；而OPG基因敲除的小鼠在出生后出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，當(dāng)加入重組OPG后能夠增加骨密度[4]。OPG和RANKL是骨代謝的最終效應(yīng)因子[5]。機(jī)體通過調(diào)節(jié)RANKL和OPG合成的比例來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和活化，以達(dá)到骨吸收的動態(tài)平衡[6]。有許多細(xì)胞因子（白介素、腫瘤壞死因子）、激素（胰島素）和蛋白（成骨蛋白）等通過影響RANKL和OPG的表達(dá)來影響骨代謝[7-8]。

糖尿病是由胰島素分泌異常而引起的內(nèi)分泌代謝性疾病，本實驗通過觀察生理和病理情況下不同濃度的葡萄糖對HPDLF中OPG、RANKL mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明高濃度的葡萄糖呈濃度依賴性抑制OPG mRNA的表達(dá)，而人體生理濃度范圍（5.5mmol/l）的葡萄糖對OPG mRNA的表達(dá)無明顯影響。另一方面，葡萄糖呈濃度依賴性上調(diào)RANKL mRNA的表達(dá)，RANKL/OPG mRNA的比值隨著葡萄糖濃度的增高而呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，與葡萄糖對OPG mRNA的下調(diào)作用相比，葡萄糖對RANKL mRNA的上調(diào)作用更強(qiáng)大。

王加林、周瑋等研究發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境導(dǎo)致具有人成骨細(xì)胞表型特征的MG63細(xì)胞中RANKL表達(dá)增多，OPG的表達(dá)減少，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[9]。王永蘭等通過對糖尿病大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病使牙槽骨局部OPG mRNA的表達(dá)降低、RANKL mRNA的表達(dá)升高，上調(diào)RANKL/OPG的比值，胰島素治療可以降低牙槽骨中RANKL/OPG的比值，減輕牙周組織炎癥反應(yīng)，減弱牙槽骨吸收，提示血糖水平的增高可能是影響糖尿病大鼠牙槽骨吸收的危險因素之一。RANKL/OPG的相對濃度決定牙槽骨的骨吸收平衡，也說明糖尿病對牙槽骨吸收的影響是通過升高RANKL mRNA的表達(dá)和降低OPG mRNA的表達(dá)兩方面起作用[10]。這也與本實驗的結(jié)果相一致。糖尿病時牙周組織通過RANKL/OPG比值，間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能，使骨代謝的平衡被打破，骨吸收大于骨形成，牙周組織局部的牙槽骨出現(xiàn)破壞和吸收。

Mahamed等發(fā)現(xiàn)OPG可以顯著減少在糖尿病小鼠中局部接種伴放線放線桿菌而引起的牙槽骨喪失，同時伴放線放線桿菌激活的CD4+T細(xì)胞中RANKL的表達(dá)顯著降低，因此OPG對糖尿病時牙槽骨的吸收有治療意義[11]。糖尿病伴牙周病的治療除了需要控制牙周局部的炎癥以外，血糖水平的控制對減少牙槽骨的喪失也至關(guān)重要。此外要加強(qiáng)人群糖尿病和牙周病患病的健康教育，充分認(rèn)識到糖尿病是促使牙周病發(fā)生和發(fā)展的全身因素，早期控制糖尿病可有效避免或減少牙周炎的發(fā)生，提高糖尿病患者的生活質(zhì)量[12]。

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