RGDS對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為的研究

[摘要]目的：觀察精氨酸-甘氨酸-天門(mén)冬氨酸-絲氨酸（RGDS）對(duì)人牙周膜細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討RGDS的作用機(jī)制及其應(yīng)用于牙周治療的可行性。方法：采用細(xì)胞培養(yǎng)、固相結(jié)合分析等方法，觀察RGDS對(duì)牙周膜細(xì)胞的黏附、伸展以及增殖、堿性磷酸酶（ALP）的影響。結(jié)果：RGDS可促進(jìn)牙周膜細(xì)胞的黏附、伸展，在濃度為25～100mg/L時(shí)作用顯著（P<0.01）， 在濃度為50～100mg/L時(shí)可明顯促進(jìn)PDL細(xì)胞增殖（P<0.05），濃度為25～100mg/L時(shí)顯著提高PDL細(xì)胞的ALP活性（P<0.05）。結(jié)論：RGDS對(duì)牙周膜細(xì)胞的黏附、伸展、增殖及ALP活性均有促進(jìn)作用，且其促黏附、伸展的作用更為顯著。

[關(guān)鍵詞]RGD；人牙周膜細(xì)胞；黏附；增殖；堿性磷酸酶

[中圖分類(lèi)號(hào)]Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2013）01-0054-03

The biological effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine acid on periodontal ligament cell

BI Ying-chun，HE Yu-hong，XI Lan-lan

（Department of Stomatology，General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese，Jinan 250031，Shandong，China）

Abstract： Objective To observe the effects of arginlie-glycine-aspartic-Serine （RGDS） peptides on the biological behaviors of human periodontal ligament cells（PDL） so as to discuss the mechanism of RGDS and the feasibility of its applications in periodontal therapy. Methods The effects of RGDS on periodontal ligament cells adhesion，extension and as well as the effects on ALP were observed by cellular culture and solid bond phase analysis. Results RGDS could promote PDL adhesion and extension with significance at the concentration of 25～100mg/L（P<0.01）； at the concentration of 50～100mg/L，it could significantiy promote PDL prolifacation（P<0.05）； at the concentration of 25～100mg/L，it could significantly increase ALP activity（P<0.05） of PDL. Conclusion RGDS can promote the adhesive，extension and proliferation as well as ALP activity of PDL，and moreover，it has more significant functions in adhesive and extension promotion.

Key words：arginlie-glycine-aspartic；human periodontal ligament （PDL） cells； adhesion； proliferation； alkaline phosphatase

精氨酸 -甘氨酸-天門(mén)冬氨酸（Arg-Gly-Asp， RGD）三肽是多種細(xì)胞跨膜蛋白整合素的特異性配體，許多黏附蛋白所共有的細(xì)胞間及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)識(shí)別的最小序列，這一序列在介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷徙和生長(zhǎng)方面起重要作用。牙周膜細(xì)胞在牙根面上的附著和增殖是牙周組織新附著的關(guān)鍵，本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察離體細(xì)胞培養(yǎng)條件下，外源性RGDS對(duì)牙周膜細(xì)胞的影響，為進(jìn)一步的臨床研究工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料：RGDS（Sigma）， 96孔培養(yǎng)板（Coster）， DMEM培養(yǎng)液和胰蛋白酶（Gibco），胎牛血清（FCS杭州四季青生物工程研究所）， 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（DG3022A）， 牛血清白蛋白（BSA，博士德公司），噻唑鹽（MTT Sigma），ALP試劑盒，倒置顯微鏡（Olympus，Japan）。

1.2 人PDL的體外培養(yǎng)：取13～17歲因正畸需要拔除的新鮮前磨牙，隨即在無(wú)菌條件下用PBS緩沖液（含青、鏈霉素各1000U/ml）浸泡5～10min，并沖洗2次，除去血液，刮取牙根中1/3的牙周膜組織，剪成1mm3碎塊，均勻鋪于培養(yǎng)瓶底，瓶底向上，加入適量含100ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在飽和濕度、50ml/LCO2、950ml/L空氣、37℃標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育2h，翻轉(zhuǎn)，培養(yǎng)至長(zhǎng)出牙周膜細(xì)胞。用2.5g/L胰蛋白酶消化法進(jìn)行傳代，用免疫組化SABC法進(jìn)行角蛋白和波形絲蛋白染色，波形絲蛋白染色陽(yáng)性，角蛋白染色陰性，證明為中胚層組織來(lái)源。取第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 PDL細(xì)胞黏附性的測(cè)試--固相結(jié)合分析[1]：將RGDS溶于PBS液，分別制成100mg/L，50mg/L， 25mg/L，12.5mg/L4種濃度，每濃度為一實(shí)驗(yàn)組。將各濃度組按每孔50μl包被96孔板，每種濃度4孔，陰性對(duì)照為10g/L BSA。將96孔板置于4℃，過(guò)夜。用PBS液洗96孔板各孔2次，加10g/L BSA，37℃封閉1h，PBS再洗2次。取第4代人PDL細(xì)胞，2.5g/L胰酶消化，離心，收集細(xì)胞，用不含血清的DMEM培養(yǎng)液吹懸細(xì)胞，形成5×108/L的細(xì)胞懸液，以每孔100μl接種于96孔板，37℃，50ml/LCO2條件下培養(yǎng)120min。取出培養(yǎng)板，PBS洗2次以去除未貼壁的細(xì)胞，2.5g/L胰酶消化，離心，將細(xì)胞懸浮于200μl無(wú)血清DMEM，血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞總量。

1.4 PDL細(xì)胞伸展性的測(cè)試：實(shí)驗(yàn)分組及96孔板的包被與實(shí)驗(yàn)方法1.3相同，用無(wú)血清DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至107/L，每孔接種100μl， 標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下孵育120min，倒置顯微鏡下觀察各孔并照相。計(jì)數(shù)伸展細(xì)胞（即至少有一個(gè)胞漿突起的細(xì)胞）數(shù)和未伸展細(xì)胞數(shù)，每組至少計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算伸展細(xì)胞的百分率。

1.5 RGDS對(duì)PDL細(xì)胞增殖的影響：實(shí)驗(yàn)分組及96孔板的包被與實(shí)驗(yàn)方法1.3相同，用無(wú)血清DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至107/L，每孔100μl接種于96孔板，10ml/LDMEM培養(yǎng)24h后，PBS 洗去未黏附細(xì)胞，重新加入10ml/L胎牛血清DMEM100μl，將96孔板置37℃、50ml/LCO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)5天后，MTT法測(cè)不同濃度RDGS對(duì)PDL細(xì)胞的影響。

1.6 RGDS對(duì)PDL細(xì)胞堿性磷酸酶（ALP）的影響：將PDL細(xì)胞按1.5的方法培養(yǎng)5天后， PBS洗3次，每孔加1ml/L TritonX-100 50μl，4℃過(guò)夜。次日每孔加堿性磷酸酶抗體100μl，37℃、50ml/LCO2孵育30min，加0.2mol/LNaOH 50μl終止反應(yīng)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀410nm檢測(cè)A值。

1.7 數(shù)據(jù)分析：運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS10.0進(jìn)行組間t檢驗(yàn)， P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 RGDS對(duì)PDL細(xì)胞黏附性和伸展性的影響：如表1所示，隨著RGDS濃度增加，其促進(jìn)PDL細(xì)胞的黏附率的作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為12.5mg/L時(shí)，與對(duì)照組相比較，既有促進(jìn)細(xì)胞黏附作用（P<0.05）在濃度為25mg/L時(shí)，差異顯著（P<0.01），說(shuō)明能有效促進(jìn)PDL細(xì)胞的黏附。

細(xì)胞伸展性實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明，在RGDS濃度為12.5mg/L時(shí)，即有促進(jìn)細(xì)胞伸展功能（P<0.01），濃度為25mg/L時(shí)，有50%以上細(xì)胞處于伸展?fàn)顟B(tài)。在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞在RGDS上伸展良好，細(xì)胞有一個(gè)或幾個(gè)突起，胞體呈梭形、多角形，未伸展的圓形細(xì)胞較少，而對(duì)照組的細(xì)胞則大多數(shù)呈圓形，無(wú)胞漿突起，即細(xì)胞伸展不良（圖1～3）。

2.2 RGDS對(duì)PDL細(xì)胞增殖和ALP的影響：RGDS在50～100mg/L可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，濃度在25～100mg/L明顯提高HPDL細(xì)胞的ALP的活性。見(jiàn)表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用固相結(jié)合分析技術(shù)，將RGDS固定于96孔板上，為排除血清中某些因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，在黏附和伸展實(shí)驗(yàn)中采用無(wú)血清的DMEM，在增殖和ALP活性檢測(cè)時(shí)，因培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)（5天），采用細(xì)胞能耐受的1%胎牛血清濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在濃度為25mg/L可顯著促進(jìn)PDL細(xì)胞的黏附、伸展，而較高濃度的促進(jìn)作用卻不明顯，可能在此濃度時(shí)細(xì)胞膜上受體位置已飽和，再增加RGDS并不能使黏附率明顯上升。而細(xì)胞伸展性也顯示，當(dāng)RGDS濃度達(dá)到25mg/L時(shí)，細(xì)胞在2h的伸展率達(dá)到了50%以上，倒置顯微鏡下可見(jiàn)經(jīng)RGDS處理過(guò)的細(xì)胞胞體呈梭行或多角性，既細(xì)胞有一個(gè)以上的突起，呈現(xiàn)良好的伸展?fàn)顟B(tài)。而未經(jīng)RGDS處理的對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)呈圓形，無(wú)突起或僅有少量突起，細(xì)胞伸展?fàn)顟B(tài)不佳。

精氨酸-甘氨酸-天門(mén)冬氨酸（RGD）是細(xì)胞外基質(zhì)中許多黏附蛋白所共同含有的一個(gè)三肽序列，它是黏附蛋白與細(xì)胞表面特異受體蛋白相互作用的識(shí)別位點(diǎn)。這些細(xì)胞表面膜蛋白被稱(chēng)為整合素（integrin）。整合素家族的分子都是由α、β兩條鏈由非共價(jià)鍵連接組成的異源雙體，為一跨膜結(jié)構(gòu)，一端連接細(xì)胞內(nèi)的骨架系統(tǒng)，另一端通過(guò)RGD識(shí)別位點(diǎn)與細(xì)胞外基質(zhì)連接，形成配體-整合素-細(xì)胞骨架跨膜信息系統(tǒng)，從而將細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架連接起來(lái)，引起細(xì)胞內(nèi)一系列生化改變：如：酪氨酸磷酸化、胞漿堿化、鈣離子濃度提高、大量磷脂代謝產(chǎn)物產(chǎn)生等，進(jìn)而影響多種組織細(xì)胞功能調(diào)控，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞的伸展、移動(dòng)、生長(zhǎng)、分化、血栓形成、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤轉(zhuǎn)移等一系列重要生理病理過(guò)程[2-3]。1984年，Pierschbacher和Ruolslahti[4]首次用實(shí)驗(yàn)證實(shí)RGDS是纖維連接蛋白與其受體的特異性結(jié)合位點(diǎn)，可促進(jìn)鼠腎成纖維細(xì)胞在生物材料表面的黏附，從此對(duì)于RGD配體與受體相互作用機(jī)制的研究引起了人們的廣泛關(guān)注。許多學(xué)者[5]研究了RGD與生物材料的不同結(jié)合對(duì)細(xì)胞在粘附、增殖、遷徙等方面的影響，顯示RGD與材料表面的穩(wěn)定的連接是促進(jìn)細(xì)胞粘附、增殖的關(guān)鍵。

ALP是參與骨等硬組織形成﹑代謝﹑再生的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，它通過(guò)水解磷酸脂﹑ATP及焦磷酸鹽，能去除鈣化抑制物，提供能量，促進(jìn)鈣化[6]。同時(shí)ALP也是細(xì)胞分化活躍和具有成骨能力的標(biāo)志之一[7]。而牙周膜細(xì)胞具骨母樣細(xì)胞特性，ALP也是牙周膜細(xì)胞分化和向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的先決條件。本實(shí)驗(yàn)中，RGDS在濃度25mg/L即可提高牙周膜細(xì)胞ALP水平，這可能是RGDS通過(guò)激活整合素受體蛋白，引起胞內(nèi)細(xì)胞骨架改變，從而促進(jìn)細(xì)胞貼壁、伸展，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖，使其分化提前，因此ALP水平的提高極可能是由于牙周膜細(xì)胞數(shù)量增加引起，但無(wú)論什么原因，RGDS這種促增殖與分化的作用在牙周組織修復(fù)過(guò)程中具有重要意義。

牙周組織再生的一個(gè)中心環(huán)節(jié)是牙槽骨和牙骨質(zhì)的重建及功能性牙周膜的完全再生，即形成牙周新附著，而PDL細(xì)胞作為具有異質(zhì)性的多能干細(xì)胞，其在根面上的黏附、生長(zhǎng)、分化是形成新附著的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)RGDS可有效促進(jìn)PDL的黏附、伸展、增殖和分化。已有學(xué)者將含有RGD的七肽固定于I型膠原材料，PDL粘附率明顯提高[8]。因而如果將RGD應(yīng)用于引導(dǎo)牙周組織再生的過(guò)程中，則有可能促進(jìn)PDL細(xì)胞在根面上黏附、伸展，激活PDL細(xì)胞成骨功能，促進(jìn)牙周組織再生，這對(duì)體內(nèi)應(yīng)用RGDS促進(jìn)牙周新附著的形成有一定的指導(dǎo)意義。

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