基質(zhì)血管成分與體外擴增的脂肪來源干細胞促進移植脂肪成活的對比研究

[摘要]目的：比較血管基質(zhì)成分（stromal vascular fraction， SVF）與體外擴增的脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells， ASCs）對移植脂肪成活的促進作用。方法：用手術(shù)方法切取家兔腹股溝脂肪，進行ASCs體外分離培養(yǎng)；取第3代ASCs分別進行成脂、成骨誘導實驗，CD29和CD31流式鑒定；制備SVF，進行CD29和CD31流式鑒定；脂肪移植裸鼠實驗分為3組：SVF、ASCs、和空白對照組（DMEM/F12），每組4只裸鼠，沿背部脊柱兩側(cè)對稱部位4個移植位點，每組共16個注射移植位點，每點0.3ml 脂肪顆粒（adipose granule， AG）+ 0.2ml細胞成分；術(shù)后4m時取材稱重、固定行HE染色觀察移植脂肪組織結(jié)構(gòu)，行CD31免疫組化染色觀察新生血管及其密度。結(jié)果：家兔ASCs體外分離培養(yǎng)成功，為貼壁生長，第3代細胞形態(tài)均呈長梭形。成脂誘導實驗油紅O染色顯示形成脂滴，成骨誘導實驗茜素紅染色顯示形成鈣化結(jié)節(jié)。流式鑒定顯示SVF：CD29：17.0%，CD31：1.3%；ASCs：CD29：96.2%，CD31：3.8%。SVF、ASCs和空白對照組各組移植脂肪成活量分別為0.2096±0.0024g，0.1798±0.0033g，0.1350±0.0020g，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。HE染色顯示SVF組移植脂肪成活較好，組織結(jié)構(gòu)完整，脂滴大小均一，可見脂肪組織中間有豐富的血管存在；ASCs組移植脂肪成活尚可，組織結(jié)構(gòu)尚完整，脂滴大小一般均一，可見脂肪組織中有結(jié)締組織纖維間隔和新生血管形成；空白對照組結(jié)締組織纖維間隔明顯增多，脂滴大小不一，有少量較大空泡形成。各組移植脂肪新生血管密度分別32.6±2.1條/mm2，29.3±1.6條/mm2，23.3±1.9條/mm2，兩兩比較均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。結(jié)論：新鮮的干細胞成分SVF比體外擴增的ASCs能更好的促進移植脂肪成活。

[關(guān)鍵詞]脂肪移植；基質(zhì)血管成分；脂肪來源干細胞；血管新生

[中圖分類號]R622 Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0035-05

Comparison between the effect of stromal vascular fraction and expanded adipose-derived stem cells on fat graft survival

ZHAO Jian-hui1， YI Cheng-gang1， QIU Xuan2， LI Long 3， LIANG Li-hua4， XIA Wei1， SU Ying-jun1， GUO Shu-zhong1

（1.Institute of Plastic Surgery， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi'an 710032， Shaanxi， China；

2. Ultrasonic Diagnosis Department， Navy General Hospital， Beijing 100048， China； 3. Department of Oral and Maxillofacial Surgery， Guanghua School and Research Institute of Stomatology， Sun Yat-Sen University， Guangzhou 510055， China；4. Department of Stomatology， Affiliated Hospital of Guilin Medical University， Guilin 541001， Guangxi， China）

Abstract： Objective To compare the effect of stromal vascular fraction （SVF） and adipose-derived stem cells （ASCs） on fat graft survival. Methods ASCs were derived from subcutaneous fat tissue of rabbit dorsa and isolated， cultured ex vivo. The third passage of ASCs were conducted on the induction to fat and bone， and flow cytometry of CD29 and CD31. After SVF had been prepared， it was performed flow cytometry of CD29 and CD31 too. There were 3 groups in nude mice experiment of fat transplantation： SVF， ASCs， and DMEM/F12 as a blank control. There were 16 injection points on the paravertebral dorsa of 4 nude mice in each group. The transplanted mixture consisted of 0.3ml adipose granule （AG） and 0.2ml cell components. 4 months after the transplantation， the mice were euthanized and the fat grafts were dissected out， weighed， and analyzed by HE staining and immunohistochemistry staining of CD31. Results ASCs were successfully isolated and cultured ex vivo， and the third passage of them were fibroblast-like adherent cells. ASCs can be induced to lipid droplets and mineralization nodes. Flow cytometry indicated that： SVF： CD29： 17.0%， CD31： 1.3%； ASCs： CD29： 96.2%， CD31： 3.8%. The survival of the fat grafts in each group of SVF， ASCs and blank control group were 0.2096±0.0024g， 0.1798±0.0033g， 0.1350±0.0020g， there existing statistical significance between multiple comparisons. HE staining showed that the fat graft in group of SVF exhibited good survival， integrity， uniform lipid droplet and rich blood vessels； fat graft in group of ASCs exhibited survival， less integrity， less uniform lipid droplets and connective tissue septa； the blank control group exhibited some large bubbles， all sizes lipid droplets， and significant fibrous septa. In each group the vascular density was 32.6±2.1 capillaries/mm2， 29.3±1.6 capillaries/mm2， 23.3±1.9 capillaries/mm2， there existing statistical significance between multiple comparison. Conclusions Fresh stem cell components SVF are more helpful than ASCs expanded ex vivo for fat graft survival.

Key words： fat transplantation； stromal vascular fraction； adipose-derived stem cells； neovascularization

目前，脂肪移植是整形外科最受矚目的研究領(lǐng)域之一。如何提高移植脂肪組織的成活率及成活質(zhì)量，是目前國內(nèi)外脂肪移植研究的關(guān)鍵性問題。文獻中報道移植脂肪的吸收率為20%～90%[1]，目前認為移植組織早期快速血管化能促進移植脂肪成活，提高脂肪成活率。自從2001年ZuK等[2]研究發(fā)現(xiàn)脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells， ASCs）以來，ASCs 被廣泛的應用于自體脂肪移植、創(chuàng)面愈合、血管新生、免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域的研究[3]。2003年，Kotaro等[4-8]開始采用細胞輔助脂肪移植術(shù)（cell-assisted lipotransfer， CAL），將自體脂肪中新鮮分離的基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction， SVF）與移植脂肪混合，提高了移植脂肪中ASCs/脂肪細胞比例，取得了不錯的臨床效果，移植物成活率大為40%～80%。魯峰等[9-10]證實ASCs治療能都促進了移植游離脂肪的成活。本實驗旨在比較新鮮的干細胞成分SVF與體外擴增的ASCs對移植脂肪成活的促進作用有無差異。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone），I型膠原酶（Sigma），胎牛血清（Gibco），二甲基亞砜（Sigma），地塞米松（Sigma），吲哚美辛（Sigma），胰島素（Sigma），異丁基甲基黃嘌呤（IBMX）（Sigma），油紅O（Sigma），β-甘油磷酸鈉（Sigma），曙紅Y（Sigma），左旋抗壞血酸（科昊生物），胰蛋白酶消化液（不含EDTA）（碧云天），青-鏈霉素（碧云天），蘇木精（上海藍季科技），茜素紅（天津科密歐），大鼠抗CD31抗體（Dako），MaxVisionTM2/HRP二抗（Dako）。細胞培養(yǎng)孵箱（Thermo），超凈工作臺（江蘇蘇凈SW-CJ-1FB），倒置顯微鏡（Nikon），酶聯(lián)免疫檢測儀（TECAN），流式細胞儀（BD FACSAriaT），空氣恒溫搖床（上海?，攲嶒炘O備KYS-100C）。

1.2 實驗動物及分組：兔脂肪和ASCs均來源于6月齡家兔，5只，雌雄不限，體重3～4kg，清潔級，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCXK-（軍）2007-007。裸鼠12只，雄性，6～8周，體重17～20g，SPF級，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號SCXK（滬）2007-0005，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院實驗動物中心，本實驗在第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)學院實驗動物中心完成。實驗過程中對動物處置符合中華人民共和國科學技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》標準。實驗分組：A組：家兔脂肪（0.3ml）+ ASCs（0.2ml，約有5×106個細胞）；B組：家兔脂肪（0.3ml）+ SVF（0.2ml）；C組：家兔脂肪（0.3ml）+ DMEM/F12（0.2ml）。

1.3 ASCs體外分離培養(yǎng) 詳見參考文獻[11]。

1.4 ASCs成脂成骨誘導分化 詳見參考文獻[11]。

1.5 SVF制備：待ASCs已經(jīng)大量擴增到第3代時，即可開始制備SVF，準備行裸鼠脂肪移植手術(shù)。手術(shù)切取家兔脂肪方法同前，脂肪量如不夠可加取腹股溝脂肪。切取脂肪后快速轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)室的超凈臺中，洗滌，剔除筋膜和血管，脂肪塊被剪碎至吸管可吸取，制備成脂肪顆粒（adipose granule， AG），取適量AG進行Ⅰ型膠原酶消化，方法同前。

1.6 SVF與ASCs流式鑒定：各取適量SVF與ASCs（常規(guī)消化離心），二者均用PBS重懸，按照每管1個抗體測試至少需要1×106/cell的要求，分裝到離心管中，送至第四軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院免疫教研室，進行CD29，CD31流式鑒定。

1.7 裸鼠脂肪移植：移植時，SVF與ASCs來源于同一只家兔。裸鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，按照分組要求，將0.2ml SVF或ASCs與0.3ml AG混合，空白對照組為0.2ml DMEM/F12培養(yǎng)液與0.3ml AG混合，用2ml注射器吸取，換上16號針頭，注射移植到裸鼠背部脊柱兩側(cè)對稱的四個移植位點，注射口用6-0尼龍線縫合1～2針，避免移植脂肪從注射口流出，放回籠中單籠飼養(yǎng)。

1.8 觀察指標與方法

1.8.1 大體觀察：四月后處死裸鼠，移植脂肪取材，稱重。

1.8.2 HE染色：移植脂肪標本固定，脫水，浸蠟，包埋制作成蠟塊，切片（厚度5μm），攤片，烤片，脫蠟，蘇木精染色、稀鹽酸酒精分化、伊紅染色、梯度酒精脫水透明、封片、鏡檢，進行組織學觀察。評價方法參考Yi等報道的方法[12]：包含4個評價參數(shù)，包括脂肪組織囊性變、纖維化、有核脂肪細胞結(jié)構(gòu)完整性、炎癥（指淋巴細胞和巨噬細胞等炎性細胞浸潤）；每個參數(shù)分為0-5六個等級：0=無；1=少量；2=比中量少；3=中量；4=比中量多；5=大量。所有組織學評價均由經(jīng)過培訓的兩位實驗人員完成。

1.8.3 CD31免疫組化染色：移植脂肪標本，行石蠟切片，脫蠟，水化，自來水沖洗；檸檬酸鈉溶液10min，高壓抗原修復；3%雙氧水室溫10min，PBS沖洗3遍各3min；除去PBS，加入1：50 PBS稀釋的大鼠抗CD31抗體室溫下孵育60min，PBS沖洗3遍各3min；除去PBS，加入1：50 MaxVisionTM2/HRP二抗，室溫下孵育15min，PBS沖洗3遍各3min；除去PBS，切片上滴加新鮮配制的加強型DAB顯色試劑顯色；自來水沖洗終止顯色，蘇木精復染，PBS返藍，經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，鏡檢。在200倍光鏡下隨機計算每張切片20個視野中血管斷面數(shù)目，計算血管斷面密度[13]。

1.9 統(tǒng)計學分析：計量資料結(jié)果均表示為x±s，等級資料用頻數(shù)描述，所有數(shù)據(jù)都使用PASW Statistics 18.0軟件分析。各組移植脂肪成活量之間的兩兩比較的方法為SNK-q檢驗，各組間HE染色組織學評價用Kruskal-Wallis H檢驗，P<0.05為兩組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ASCs體外分離培養(yǎng)：ASCs原代第一次換液即可見部分貼壁細胞，形態(tài)呈短梭形，未貼壁細胞形態(tài)略呈不規(guī)則圓形，換液即去掉部分未貼壁細胞。第3代細胞形態(tài)比較規(guī)則，呈長梭形，低倍鏡下觀察均呈旋渦狀生長，見圖1。

2.2 成脂成骨誘導分化：交替使用成脂誘導和成脂維持培養(yǎng)液后1周左右，ASCs周圍即可出現(xiàn)散在的脂滴，逐漸增多增大，鏡下可見細胞核周圍出現(xiàn)透亮的圓形物質(zhì)，油紅O染色可見染為紅色，對照組未見脂滴出現(xiàn)，見圖2。成骨誘導培養(yǎng)后3周左右時行茜素紅染色，ASCs可見大小不一的紅色鈣化結(jié)節(jié)，不同視野鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于rASCs，對照組未見細胞周圍鈣鹽沉積，見圖3。

2.3 SVF與ASCs流式分析：SVF與ASCs的流式分析結(jié)果見圖4：SVF：CD29：17.0%，CD31：1.3%；ASCs：CD29：96.2%，CD31：3.8%。

2.4 移植脂肪成活量：脂肪移植后4月時裸鼠都存活，處死取材稱重，各組移植脂肪成活量見圖5，SVF、ASCs和空白對照組各組移植脂肪成活量分別為0.2096±0.0024g，0.1798±0.0033g，0.1350±0.0020g，組間兩兩比較均有統(tǒng)計學意義，P<0.05，移植脂肪成活量SVF組>ASCs組>DMEM/F12組。

2.5 組織學觀察：4月時各組移植脂肪HE染色結(jié)果可見圖6：SVF組移植脂肪成活較好，組織結(jié)構(gòu)完整，脂滴大小均一，可見脂肪組織中間有豐富的血管存在；ASCs組移植脂肪成活尚可，組織結(jié)構(gòu)尚完整，脂滴大小一般均一，可見脂肪組織中有結(jié)締組織纖維間隔和新生血管形成；空白對照DMEM/F12組結(jié)締組織纖維間隔明顯增多，脂滴大小不一，有少量較大空泡形成。對4月時的移植脂肪組織HE染色結(jié)果進行組織學評價，各組之間囊性變、纖維化、完整性、炎癥之間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

2.6 CD31免疫組化染色：CD31免疫組化染色顯示移植脂肪中有新生血管形成，見圖7，SVF、ASCs和空白對照組各組移植的脂肪血管密度分別為32.6±2.1條/mm2，29.3±1.6條/mm2， 23.3±1.9條/mm2，兩兩之間比較，差異均有統(tǒng)計學意義，P<0.05。

3 討論

20世紀80年代，吸脂術(shù)的發(fā)明帶來了顆粒脂肪移植技術(shù)，使移植脂肪的成活率有一定程度上的提高。Illouz[14]認為抽脂術(shù)后的脂肪不是一塊完整的組織，而是已經(jīng)分離的細胞，注射移植到體內(nèi)后，能夠依靠機體周圍組織的滲透和血管新生提供營養(yǎng)而成活。自體顆粒脂肪移植在臨床有著廣泛的應用前景，盡管有大量的基礎與臨床研究，但是脂肪移植后吸收率依舊很高，報道效果不一，而且并發(fā)癥較多[15]。促進移植脂肪成活的關(guān)鍵是移植后盡快建立血運[9，12，16，17]，近些年的研究熱點，主要集中在利用干細胞治療促進移植脂肪成活上[4-8]，利用吸脂的脂肪經(jīng)I型膠原酶消化后獲取的ASCs來促進移植脂肪的成活，Kotaro等[7]認為ASCs不僅能分化為脂肪細胞，血管內(nèi)皮細胞，也可能分化為血管平滑肌細胞和周細胞等，而且能分泌促血管新生的生長因子，故有助于移植脂肪早期血管新生，促進移植脂肪成活、再生和更新。

本實驗擬比較SVF與ASCs對移植脂肪成活的促進作用，尋找更有效的促進脂肪成活的方法。ASCs為體外擴增至第3代的間充質(zhì)干細胞，經(jīng)過貼壁篩選純化和流式鑒定；SVF為脂肪經(jīng)Ⅰ型膠原酶消化后的富含新鮮ASCs的混合成分。體外細胞實驗結(jié)果顯示：體外分離培養(yǎng)的ASCs為貼壁生長，呈梭形，旋渦狀生長；具有成脂、成骨誘導能力；流式鑒定證實其CD29+，CD31-，以上結(jié)果證實其干細胞特性。SVF為混合細胞成分，CD29陽性率都有所下降，CD31表達則均較少。體外脂肪移植實驗顯示：移植脂肪成活量SVF組>ASCs組>DMEM/F12組；HE染色顯示SVF組移植脂肪成活較好，ASCs組移植脂肪成活尚可，空白對照DMEM/F12組成活較差；各組新生血管密度為SVF組>ASCs組>DMEM/F12組。

SVF是指脂肪組織消化離心去掉上層組織和油后，沉淀在底層的細胞成分，包括ASCs、血管內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞、周細胞以及大量血液循環(huán)來源的細胞，比如白細胞、紅細胞等。Suga[18]等發(fā)現(xiàn)從抽脂術(shù)后獲得的SVF中ASCs（CD31﹣CD34﹢CD45﹣）占到35%，其他有核細胞包括白細胞（CD45﹢）占37%，內(nèi)皮細胞（CD31﹢CD34﹢CD45﹣）占15%，還有其他細胞（CD31﹣CD34﹣CD45﹣）。SVF 是CAL中最重要的成分，Kotaro等[4-8]證實SVF對移植脂肪成活的促進作用，與本實驗結(jié)果一致，本實驗還發(fā)現(xiàn)新鮮的干細胞成分SVF比體外擴增的ASCs能更好的促進移植脂肪成活，SVF安全、簡便且可操作性強。體外擴增的ASCs增殖和分化能力不一致，同時其具有免疫抑制效果，以及潛在的促進腫瘤形成作用等等，都可能影響其臨床應用[19]。關(guān)于干細胞治療在自體脂肪移植中應用，Eaves等[20]持謹慎態(tài)度，認為盡管干細胞在自體脂肪移植中有潛在益處，但是必須經(jīng)過大量進一步的研究和臨床試驗證實才能下結(jié)論，并鼓勵開展進一步的機制研究。自體脂肪移植的前景是光明的，相信不久的將來，將會解決移植脂肪成活率低的問題，使其更廣泛的應用于臨床。

（致謝：本課題要衷心感謝第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院實驗動物中心全體工作人員、第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院整形外科劉蓓、余州、宋雅娟技師以及西京醫(yī)院病理科王映梅老師的大力支持和幫助。）

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