斑點雜交法檢測正畸大鼠三叉神經(jīng)節(jié)PPTAmRNA的變化

[摘要]目的：觀察正畸牙齒移動不同時期大鼠三叉神經(jīng)節(jié)（Trigeminal Ganglion ，TG）中前速激肽原A（PPTA）mRNA的表達變化，初步探討牙齒移動導致疼痛的可能機制。方法：采用斑點雜交的方法檢測正畸加力后不同時期大鼠TG內(nèi)PPTAmRNA水平的變化情況。結(jié)果：加力2h大鼠三叉神經(jīng)節(jié)PPTA mRNA的表達量開始增加，加力8h至加力3天達到最高，至第7天 PPTA mRNA水平仍然明顯高于對照組。結(jié)論：正畸牙齒移動能導致TG內(nèi)PPTAmRNA表達水平的上調(diào)，提示PPTA可能參與了正畸疼痛的發(fā)生。

[關鍵詞]P物質(zhì)；前速激肽原A（PPTA）；牙齒移動；正畸疼痛；三叉神經(jīng)節(jié)（TG）；斑點雜交

[中圖分類號]R332 R783.5 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0067-02

Changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during Tooth Movement using Dot-blot hybridization method

YIN Yue，SUN Ying-ming

（1.Anhui Medical University，School of Stomatology，Hefei 230032，Anhui，China； 2.Department of People's Liberation Army 101 Hospital Dental，Wuxi 214044，Jiangsu，China）

Abstract： Objectives To investigate the changes in the Expression of PPTA mRNA in the Rat trigeminal Ganglion during Tooth Movement. Methods The changes in the expression of PPTA mRNA in the rat trigeminal ganglion，during tooth movement in different periods，were detected using Dot-blot hybridization. Results The expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion was stonger than that in blank group and control group at all the time points； PPTA mRNA level was increased after 2 hours and reached the peak level around 8 hours to 3 days during tooth movement，7days after tooth movement PPTA mRNA level was still higher than in control group. Conclusion Orthodontic tooth movement can lead to a stonger expression of PPTA mRNA in trigeminal ganglion， suggesting that the PPTA may be involved in the occurrence of orthodontic pain.

Key words：substance P；PPTA；tooth movement；orthodontic pain；trigeminal ganglion；Dot-blot hybridization

疼痛是正畸治療中的一個常見反應[1]。正畸治療中牙齒疼痛與不適主要來源于牙周組織在改建時釋放的疼痛介質(zhì)，是一個復雜的綜合性生理過程。而P物質(zhì)（Substance P，SP）是發(fā)現(xiàn)最早的神經(jīng)肽，目前已證實SP參與痛覺的傳遞[2]。牙齒及牙周組織中的SP是由三叉神經(jīng)節(jié)（Trigeminal Ganglion ，TG）合成，PPTA是編碼SP的前體。在牙齒移動中，三叉神經(jīng)節(jié)SP陽性神經(jīng)元可能發(fā)生相應的改變。我們采用斑點雜交的方法檢測正畸牙齒移動不同時期大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)PPTAmRNA表達水平的變化，探討正畸牙齒移動導致疼痛的可能機制。

1 材料和方法

1.1實驗分組、動物模型制備和取材：SD雄性大鼠，體重（180±20）g（7～9）周。加力裝置采用結(jié)扎絲將一根鎳鈦螺旋拉簧一端扎在上頜第一磨牙上，另一端結(jié)扎在上頜中切牙上，并用自凝塑料加固結(jié)扎絲與牙連接處。加力力值為50g，使磨牙向近中移動。大鼠隨機分為實驗組（安置裝置加力）、對照組（安置裝置不加力）。將實驗組和對照組根據(jù)不同時間分為以下亞組：2h組，8h組，1天組，3天組，7天組。每組5只大鼠，共50只大鼠。待大鼠達到規(guī)定時間點后，將動物乙醚吸入麻醉后迅速斷頭取三叉神經(jīng)節(jié)，放入液氮中速凍。

1.2 組織總RNA的提?。翰捎卯惲驓渌犭乙徊椒ㄌ崛〈笫笕嫔窠?jīng)節(jié)總RNA。RNA純度260/280比值>1.9。

1.3 斑點雜交（Dot blotting）檢測：取總RNA加等體積的RNA變性液65℃變性30min。取10μg變性RNA點于尼龍膜，室溫靜止20min，按照1.5J/cm2 254nm波長紫外線照射1.8min待用。實驗用探針序列與大鼠腦內(nèi)PPTAmRNA的第175號堿基到第204號堿基互補（5′-gatga tctaa attat tggtc cgact ggtcc -3′）。將尼龍膜和預雜交液封于雜交袋中，42℃預雜交16h，將標記探針2μg加入雜交袋中，42℃，12h。洗膜后探針檢測采用酶標抗地高辛抗體（過氧化物酶系統(tǒng)），DAB顯色。掃描儀掃描，計算個樣本灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法：實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗結(jié)果用x±s表示，組組之間采用t檢驗分析，P<0.05認為有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

斑點雜交檢測結(jié)果顯示不同時間點各對照組之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差異；在正畸牙齒移動過程中大鼠三叉神經(jīng)節(jié)PPTA mRNA的表達發(fā)生了明顯的變化，并具有一定的規(guī)律性。加力2h大鼠三叉神經(jīng)節(jié)PPTA mRNA的表達量開始增加，加力8h至加力3天達到最高，至加力7天時PPTA mRNA水平仍然明顯高于對照組和空白組（P<0.05）。見圖1、表1。

3 討論

SP是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽，由11個氨基酸組成，是1931年Von Euler等在研究馬體內(nèi)乙酰膽堿時發(fā)現(xiàn)的一種物質(zhì)。20世紀70年代分離純化了SP，進而確定了其組織結(jié)構(gòu)，同時SP也是牙髓組織中發(fā)現(xiàn)的第一個神經(jīng)肽[3]。三叉神經(jīng)節(jié)中存在SP陽性神經(jīng)元，并且主要位于中小神經(jīng)元內(nèi)[4]。三叉神經(jīng)節(jié)初級感覺神經(jīng)元是疼痛的起始部位。傳導口腔頜面部疼痛的初級感覺神經(jīng)元位于三叉神經(jīng)節(jié)。在牙齒移動中三叉神經(jīng)節(jié)SP神經(jīng)元興奮，引起SP的釋放，一方面釋放至外周末梢參與疼痛的發(fā)生，另一方面向上至三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核（caudal spinal trigeminal nucleus，VC）傳遞痛覺信息。

SP是公認的疼痛傳遞介質(zhì)，具有增強傷害性信息傳遞的功能。SP被認為對疼痛信號的傳遞呈雙重作用，在傳人的神經(jīng)元中為興奮性介質(zhì)，但在高級中樞神經(jīng)及其調(diào)制中則降低疼痛的敏感度。Henry等[5]認為，SP作為神經(jīng)遞質(zhì)在疼痛的感覺傳遞和鎮(zhèn)痛機制中發(fā)揮著重要作用。在正畸治療的初期，SP可能是導致牙齒輕微疼痛和不適癥狀的原因之一：（1）SP可使牙髓內(nèi)局部血管擴張、通透性增加，髓腔內(nèi)壓上升以至牙髓微循環(huán)障礙，導致C纖維興奮性增加，興奮閾值降低；（2）SP可以介導產(chǎn)生內(nèi)源性致痛物質(zhì)，間接引起C纖維興奮閾值降低[6]，如：①SP在C纖維支配的局部區(qū)域可引起血管擴張，通透性增加，血管內(nèi)液體的深處可以激活緩激肽類物質(zhì)；②SP作用于肥大細胞可使肥大細胞脫顆粒，釋放組胺等。SP的作用并不是孤立的，而是與神經(jīng)系統(tǒng)及其它遞質(zhì)相互作用、相互配合而發(fā)揮作用的。另一方面，神經(jīng)系統(tǒng)不同部位、不同程度的損傷，SP的含量也隨著發(fā)生變化，通過測定SP的動態(tài)變化，可在一定程度上推測其功能的恢復情況。

本研究采用斑點雜交的方法觀察正畸牙齒移動不同時期大鼠三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)PPTAmRNA水平的變化情況，從SP中樞合成和mRNA水平來揭示正畸疼痛的變化規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)加力2h后PPTAmRNA的表達量開始增加， 加力 8h至加力3天達到高峰，至加力7天后仍然明顯高于對照組和空白組。該結(jié)果與Norevall的外周SP神經(jīng)變化的發(fā)現(xiàn)相一致[7]。筆者發(fā)現(xiàn)大鼠正畸牙齒移動過程中三叉神經(jīng)節(jié)PPTAmRNA的表達發(fā)生了明顯的變化，表達水平上調(diào)，并具有一定的規(guī)律性，說明牙齒移動的刺激能增強PPTA在大鼠三叉神經(jīng)元的表達，表明牙齒移動產(chǎn)生了疼痛反應。SP經(jīng)軸漿運輸?shù)竭_三叉神經(jīng)纖維外周端末梢并釋放到牙髓或牙周組織，參與牙齒移動導致的疼痛反應，SP也可能到達三叉神經(jīng)纖維的中樞端并向三叉神經(jīng)脊束核釋放，從而加強牙齒移動引起的痛反應。研究發(fā)現(xiàn)[8]：牙周疼痛發(fā)生時間在正畸加力后1～12h不等，平均為4～5h，在24～48h疼痛達到最高峰，加力后72h疼痛程度才逐漸減輕。可以看出，實際臨床中患者的疼痛規(guī)律和本研究發(fā)現(xiàn)的TG中PPTAmRNA的變化規(guī)律呈一定的相關性。說明SP參與了正畸疼痛的發(fā)生，但具體的作用機制還有待進一步的研究。

[參考文獻]

[1]顧敏，李琥，吳拓江，等.正畸疼痛的分析與控制[J].口腔醫(yī)學，2009，29（5）：269-271.

[2]Omur Pain.Pain and Discomfort After Orthodontic Appointments[J].Semin Orthod，2007，13：292-300.

[3]Olgart L，Hokfelt T，Nilsson G，et a1.Localization of substance P like immunoreactivity in nerves in the tooth pulp[J].Pain，1977，4（2）：153-159.

[4]Tuiska F，Hildebrand C.Combined retrograde tracing and immunohistochemistry of trigeminal ganglion neurons projecting to gingive or tooth pulp in the lower jaw of the cichlia Tilapia mariae[J]. J Neurocytol，1997，26（1）：33.

[5]Henry JL.Future basic science directions into mechanisms of neuropathic pain[J].J Orofac Pain，2004.18（4）：306-310.

[6]孫應明，羅頌椒.免疫熒光法觀察P物質(zhì)神經(jīng)纖維在大鼠牙髓及牙周組織中的分布[J].中國美容醫(yī)學，2006，15（07）：780-781.

[7]Norevall LI，F(xiàn)orsgren S，Matsson L.Expression of neuropeptides during and after orthodontic tooth movement in the rat[J].J Eur Ortho，1995，17（4）：331-325.

[8]鄭衍亮.固定正畸治療時患者牙周疼痛影響因素的觀察[J].中國行為醫(yī)學科學，200l，10（4）：324-325.