組織工程骨—軟骨復合組織體內異位移植的研究

[摘要]目的：本實驗構建組織工程骨軟骨復合組織并采用異體異位移植方式，探討外來因素對移植物的影響，為進一步研究奠定基礎。方法：制備明膠-硫酸軟骨素-透明質酸及明膠-陶瓷化骨多孔復合支架，復合軟骨細胞和骨髓間充質干細胞，將上述組織按照體外培養(yǎng)時間不同分為4組，植入裸鼠皮下，觀察復合組織形成情況。結果：各實驗組在觀察期內裸鼠背部均無感染，復合組織表面完整薄層纖維層下可見類似透明樣軟骨組織，體積均出現(xiàn)不同程度的收縮。HE染色各實驗組均可發(fā)現(xiàn)，在軟骨層和骨層，分別可見成軟骨細胞、軟骨細胞、骨細胞及相應的細胞外基質，且可以觀察到類似正常結構的潮線出現(xiàn)，交界區(qū)軟骨組織出現(xiàn)骨化，在組織外圍，出現(xiàn)了不同程度向纖維樣組織轉變的現(xiàn)象。結論：經過體外短時間的誘導使得細胞具有分化趨勢后，早期植入體內有助于組織工程骨-軟骨復合組織的形成。

[關鍵詞]骨軟骨；組織工程；異位移植

[中圖分類號]R318 R622 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0051-04

Study on heterotopic transplantation of tissue engineering osteochondral composites

DENG Tian-zheng，LV Jing，YANG Jie-fei，KE Jie

（Department of stomatology，Air Force General Hospital PLA，Beijing 100142，China）

Abstract： Objective To construct tissue engineering osteochondral composite tissue，and undergo allogeneic transplantation. Discusses the influence of the external factors on the graft， and establish the foundation for the further research. Methods Gelatin-chondroitin sulfate-hyaluronic acid-gelatin-ceramic osteochondral composites scaffolds were ontracted， and seeded with chondrocyte and bone mesenchymal stem cells. Transplanted subcutaneously into nude mice according to different time and then analyzed histogenesis after the operation. Results There was no infection on dorsum in each group during observation period. It could be seen hyaline cartilage like tissue on the surface of composite tissue surface. The volume appeared smaller than pre-operation. HE stain showed cartilage cells cells， osteocyte and extracellular matrix respectively in cartilage and bone layer.It also can be seen tide line similar as nature tissue. In junctional area cartilage appeared ossification， and in peripheral tissue it appeared fibrosis. Conclusion It can be concluded that after short time induced in vitro，the cells have differentiation trend， it will be benefit for forming osteochondral composite tissue.

Key words：osteochondral；tissue-engineering；heterotopic transplantation

構建組織工程化骨-軟骨復合組織的臨床目的就是希望能夠在體內形成有效的骨-軟骨組織，從而能夠發(fā)揮其應有功能[1]。組織工程移植物在體內形成組織有很多關鍵的影響因素，例如體外復合時間、方式、體內植入時機、體外誘導因素、植入體內部位、受床血供、周圍組織健康狀況、周圍組織支撐情況、受者免疫排斥等問題[2]。從目前文獻看大多數學者支持采用自體細胞原位移植，這樣可就最大程度避免了免疫排斥以及異位移植缺乏相應的生長因子及功能刺激等因素[3]。但采用異體細胞異位移植更能說明移植物形成組織情況，本實驗采用了異體異位移植方式，探討外來因素對移植物的影響，為進一步研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料：2周齡新西蘭大白兔4只，雄性，體重0.4kg；6周齡裸鼠5只（由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供）。速眠新（軍科院獸研所 中國長春）、DMEM/F12低糖培養(yǎng)基（Gibco 美國）、胎牛血清（四季青 中國）、II型膠原酶（Gibco美國）、0.25%胰蛋白酶（Sigma美國）、地塞米松（Sigma 美國）、抗壞血酸（Sigma 美國）、β-甘油磷酸鈉（Sigma 美國）、明膠粉劑（Sigma，美國）、硫酸軟骨素粉劑（Sigma，美國）、透明質酸鈉（正大福瑞達藥業(yè)公司，中國山東）、碳化二亞胺（EDC，Sigma，美國）、倒置顯微鏡及顯像系統(tǒng)（Olympus日本）、低溫高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）、BB16型CO2培養(yǎng)箱（Heraeus美國）、SW-CJ-1B型超凈工作臺（蘇凈集團），其他試劑均為國產分析純，購自北京化學試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 種子細胞的分離培養(yǎng)及鑒定：實驗采用兔耳原代軟骨細胞和第三代成骨誘導的骨髓間充質干細胞（BMSC）為種子細胞，實驗方法參照我們前期實驗[4]。

1.2.2 實驗分組：體外復合后根據共培養(yǎng)時間不同分為：1天組（A）、7天組（B）、14天組（C）、無細胞組（對照組D），每組4例，共16例。

1.2.3 骨軟骨復合支架制備：選一健康實驗兔，處死后取出完整關節(jié)。以藻酸鹽印模材制取兔關節(jié)模型陰模數個，普通石膏灌制關節(jié)模型陽模后自凝塑料制備成具備兔關節(jié)外形的陰模。模型消毒后備用。新鮮小牛肋骨（北京市安定屠宰場）雕刻成類似關節(jié)外形，經脫脂、脫蛋白，置于馬佛爐中緩慢加溫至800℃，持續(xù)3h后取出，冷卻后浸入37℃、0.5%明膠溶液30min，充分浸透后500r/min離心1min，作為骨層備用。參考fan等[5]的制備方法，以0.5g明膠粉劑、0.1g硫酸軟骨素粉劑和5mg透明質酸鈉加入7ml三蒸水中，38℃下攪拌至溶解，并注入預先制備好的模具內，作為軟骨層。待軟骨層完全結固前將骨層支架插入，插入深度小于1mm，室溫下冷卻后，放入-20℃冰箱過夜后行抽真空凍干。凍干后將復合支架浸入無水乙醇60min，再置入70%和50%乙醇中各30min，浸入50mmol/L碳化二亞胺的95%乙醇溶液中，室溫交聯(lián)24h。三蒸水超聲清洗3 遍后真空凍干。使用前修整骨層與軟骨層厚度，軟骨層約2mm，骨層不大于10mm。

1.2.4 復合細胞：將第三代誘導后的骨髓間充質干細胞消化后以2×106/ml的密度接種于骨層，使支架完全被浸透而無溢出，37℃、5%CO2、飽和濕度靜置培養(yǎng)2h后，反轉材料，注入礦化誘導液培養(yǎng)，液平面位于雙層結構連接處，此時將原代兔耳軟骨細胞消化后以5×107/ml的高密度同樣方法接種于軟骨層，2h后，將液平面提升到剛剛沒過支架處。三維培養(yǎng)2天后進行移植實驗。

1.2.5 體內異位移植：復合后根據分組情況形裸鼠皮下移植并連續(xù)觀察8周，每只裸鼠根據體形大小植入2或4塊復合組織，所有組織在一天內全部植入裸鼠體內。

1.2.6 檢測指標：組織植入后于第2、4和8周取材，取材時輕輕剝離表面纖維層，充分暴露其下方的移植組織，以4%多聚甲醛固定30min，放入脫鈣液內避光脫鈣24h，取出后梯度脫水石蠟包埋。進行大體觀察、HE染色。

2 結果

2.1 大體觀察：各實驗組在觀察期內裸鼠背部均無感染或瘺管出現(xiàn)，分別在體內培養(yǎng)2、4、8周時取材，形成的組織與裸鼠皮下周圍組織似形成潛在間隙因此可以輕松剝離，復合組織表面包被纖維組織，并可以觀察到脈管系統(tǒng)爬行于其表面（圖1、2），脈管系統(tǒng)隨體內植入時間延長呈現(xiàn)逐漸密集趨勢；復合組織表面完整薄層纖維層下可見類似透明樣軟骨組織。觀察期內各組組織三維形狀無明顯變化，但體積均出現(xiàn)不同程度的收縮，尤以C組最為顯著，說明材料在體內出現(xiàn)降解或崩解。觀察發(fā)現(xiàn)各實驗組中組織收縮情況與組別有關，即隨體外復合時間延長體積收縮越大（表1）。對照組中無感染出現(xiàn)，移植物表面同樣可見纖維包裹并有脈管網形成，但部分區(qū)域可見外露支架，將表層纖維組織去除可觀察到支架結構，支架吸收明顯，體積較實驗各組變小。

2.2 組織學觀察：2周時HE染色見A組支架材料部分降解，殘余的材料間及周圍有大量的軟骨樣組織形成，細胞呈類圓形，胞核居中，基質成分較多，可見軟骨陷窩，軟骨層內內無血管長入，中央區(qū)域可見軟骨團對照組殘余材料間及材料周圍為纖維結締組織，在雙層組織過渡區(qū)可以觀察到少量軟骨細胞和成骨細胞向對方組織支架內爬行生長，呈相互嵌入式生長，且基本保持了自身的表型特點。這種生長方式有助于兩層組織間的結合，并形成類似與正常組織的結構。由于脫礦過程中骨層支架材料溶解，而形成的細胞外基質還不能足以保持組織形態(tài)，所以骨層組織呈現(xiàn)缺失狀態(tài)但在剩余組織材料間隙及周圍可見片狀骨組織，部分為未完全鈣化的軟骨組織，部分形成骨小梁， 可見新生的類血管樣管狀結構（圖3）。B組、C組與A組接近，所形成的組織基質較A組更明顯，但中心區(qū)域可見到少量無細胞支架結構，骨層可見散在片狀類骨樣組織。4周時A組的軟骨層支架大部分降解，為較成熟的軟骨組織替代；骨層支架亦部分降解，可見更多骨小梁結構形成。兩部分交界處有部分殘余支架材料，新生的軟骨和骨組織部分為骨和軟骨直接連接（圖4）。B組、C組軟骨層表層逐漸向纖維組織改變，但深部區(qū)域仍為軟骨樣結構，骨層支架部分降解，組織外緣逐漸被纖維組織包裹替代，骨軟骨結合處依然為骨和軟骨的直接連接，但并不完整。8周時A組復合體形成結合良好的骨-軟骨組織。組織學觀察發(fā)現(xiàn)，在軟骨層和骨層，分別可見成軟骨細胞、軟骨細胞、骨細胞及相應的細胞外基質，且可以觀察到類似正常結構的潮線出現(xiàn)，交界區(qū)軟骨組織出現(xiàn)骨化，在組織外圍，出現(xiàn)了向纖維樣組織轉變的現(xiàn)象（圖5）。B組、C組可以觀察到更多的纖維組織形成，且纖維組織向復合組織內部生長。對照組兩部分均可見殘余支架材料及纖維結締組織和新生血管。

3 討論

本研究構建的組織工程骨-軟骨復合組織在體內異位可形成骨-軟骨樣組織，這與其他一些學者的研究結果一致[6-8]。新形成的組織外層包被一層纖維組織，該現(xiàn)象說明本實驗所用的移植物具有很好的生物相容性，更重要的是這一現(xiàn)象還提示移植物在體內形成了具有其自身特點的組織，與所埋植的區(qū)域具有明顯不同的組織結構和特點。在本實驗中觀察到良好的骨及軟骨層間的過渡區(qū)域，從組織學上觀察，可以明顯地觀察到兩層組織分界，類似正常組織分界。在骨與軟骨過渡區(qū)，可以觀察到至少三種形態(tài)的細胞，包括類似肥大軟骨細胞和軟骨前體細胞以及細胞形態(tài)更小的細胞，他們多數存在于軟骨或骨陷窩內。且這一層的基質分泌情況要比上方軟骨層明顯減少，組織間隙變大，這也與脫礦后形成的組織間隙有關。且過渡區(qū)軟骨組織邊緣的基質有鈣化跡象，這可能與非關節(jié)環(huán)境下組織血供豐富有關。過渡區(qū)那些較小的細胞呈現(xiàn)多角形或不規(guī)則圓形，分析可能是一小部分受區(qū)BMSC滲透到支架內部與軟骨細胞接觸并在軟骨細胞的誘導下向軟骨細胞分化，其他遠離軟骨細胞的則向成骨細胞方向分化。也說明細胞間接觸誘導是確定的，不同細胞分泌的細胞因子及基質確實參與了細胞誘導分化[9]。隨著體內培養(yǎng)時間的延長，各組中軟骨層均出成纖維樣結構，可能由于功能需要軟骨組織正逐漸形成纖維軟骨，如果繼續(xù)培養(yǎng)可能出現(xiàn)移植組織最終形成纖維組織[10]。而在關節(jié)環(huán)境下的成軟骨作用及對骨-軟骨缺損的修復效果，將是我們進一步的研究內容。

本實驗中，A組體外復合培養(yǎng)時間最短，因此細胞大量黏附在支架孔隙表面，還沒有形成細胞外基質，這樣就能夠保證植入體內后營養(yǎng)物質與代謝產物的交換，同時實驗中還發(fā)現(xiàn)在體內組織形成過程中骨層內部有管腔樣結構形成，說明組織在形成過程中可能有血管長入骨層，這樣就為組織內部的生長提供了代謝途徑，保證了組織內外協(xié)調生長，不會因為組織內部營養(yǎng)代謝問題導致內部組織的壞死進而發(fā)生更大面積的破壞甚至失敗。在軟骨層則沒有發(fā)現(xiàn)有管腔樣結構出現(xiàn)，這與正常軟骨組織相符，同樣也符合軟骨組織生長規(guī)律[11]。如果軟骨內有血管長入那么軟骨層將逐漸出現(xiàn)纖維化，而且軟骨細胞存在于軟骨基質內，其營養(yǎng)供應依靠滲透獲得，即處于一種缺氧狀態(tài)，如果血管長入將改變這種環(huán)境最終使得軟骨細胞去分化、表型喪失、功能喪失等[12]。

上述結構的出現(xiàn)也進一步說明該支架是適合復合組織生長的。骨層由于孔隙較大，使得血管樣組織早期即能向組織內部生長，而軟骨層孔隙小則不利于管腔樣組織的形成。同時，由于選用的細胞具有較強的分泌基質能力，早期即可形成大量基質因而進一步阻塞了支架孔隙妨礙了管腔長入。而隨著體外培養(yǎng)時間的延長，隨著基質分泌的增多特別是周邊細胞營養(yǎng)充分，細胞團外基質分泌較旺盛，就必然將支架孔隙封閉，細胞團中心部位細胞由于營養(yǎng)彌散受限而易發(fā)生死亡，最終將導致支架內部與外部組織形成的不一致，外部形成薄層組織而內部則沒有，尤其是植入體內后，很有可能因為支架內部尤其是骨層細胞缺乏營養(yǎng)導致細胞無法長期存活發(fā)揮功能使得內部形成空腔結構使得組織塌陷等，也就無法滿足缺損區(qū)的修復要求。因此，可以認為經過體外短時間的誘導使得細胞具有分化趨勢后，早期植入體內有助于組織工程骨-軟骨復合組織的形成[13-14]。

本實驗體內形成的軟骨層通過大體觀察組織化學觀察和顯微熒光觀察都顯示出軟骨特點，同時形成的軟骨層厚度有2mm左右，而正常人股骨頭關節(jié)軟骨接近韌帶區(qū)厚度平均約2.8mm[15]，中間及外側區(qū)域軟骨厚度約1.1～1.3mm。實驗中發(fā)現(xiàn)A組4周時軟骨層厚度在降低，而在8周時軟骨層厚度反而增加，其他實驗組則在8周內軟骨層厚度在逐漸降低，說明A組中的軟骨在生長過程中具有與正常軟骨組織類似的形成方式，能夠不斷地分泌軟骨基質來保持軟骨結構的完整性，此外這可能也與體外復合時間長短有關。然而，異位培養(yǎng)時間增加，軟骨層厚度是能否增加還是或者吸收，是否導致軟骨表型逐漸喪失都將是需要進一步闡明的問題。

作為骨-軟骨復合組織移植物最重要的就是功能恢復[16]。雖然天然組織的幾何形態(tài)尤其是過渡區(qū)的帶狀結構并沒有在所構建的移植物中明確出現(xiàn)，但觀察到很多類似天然結構的一些特征性結構仍然出現(xiàn)在軟骨層，例如軟骨陷窩、細胞分層排列、細胞內外基質形成以及特有的圓形細胞形態(tài)等。事實上很多報道稱體外形成的骨-軟骨復合組織植入體內后可以最終改建成與正常軟骨結構一樣的帶狀拱形結構的透明軟骨[17-18]。因此可以推測，在體內機械應力和生物誘導條件下組織工程組織可以改建并最終與機體相適應。

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