EdU體外標(biāo)記人脂肪干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

[摘要]目的：體外培養(yǎng)人脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）并行EdU標(biāo)記，并通過測試標(biāo)記率及標(biāo)記后對細(xì)胞增殖分化的影響確定優(yōu)化的標(biāo)記時間及濃度組合。方法：使用分別采5μM，10μM，20μM，50μM的濃度及12h，24h進(jìn)行標(biāo)記標(biāo)記ADSC，并以流式細(xì)胞儀精確測定標(biāo)記率。挑選出各12h及24h時優(yōu)化標(biāo)記濃度，并進(jìn)行標(biāo)記后測定細(xì)胞活性，增殖及誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：P3代細(xì)胞約90%以上表達(dá)表面標(biāo)記CD90+，CD105+，CD44+。基本不表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記CD45+，CD35+。通過各試驗(yàn)，得出最適濃度組合10μM，12h，對進(jìn)一步研究脂肪干細(xì)胞在輔助脂肪移植中的作用具有指導(dǎo)意義。結(jié)論：EdU是標(biāo)記方法簡單有效，體外最佳標(biāo)記濃度組合是10μM，12h。

[關(guān)鍵詞]脂肪干細(xì)胞；細(xì)胞治療；EdU；干細(xì)胞標(biāo)記；細(xì)胞示蹤

[中圖分類號]R622 Q813.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0043-05

Experimental study on the effect of labeling adipose derived stem cells with EdU

ZHANG Yi，WANG Ke-ming，LI Fa-cheng，WANG Shu-jie，LI Tai-ying，LIU Xin-hai，LIU Mei-chen，ZHAO Xiao-hui，MA Ji-guang

（Special Medical Department，Plastic Surgery Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100144，China）

Abstract： Objectives To establish the best method and optimal concentrantion and optimal time for labeling ADSC with thymidine analog，5-ethynyl-2-deoxyuridine（EdU）. Methods ADSC at passage 2～4 were labeled with EdU by diverse concentration （5μM，10μM，20μM，50μM）and diverse time（12h，24h）.After labeled， the cell were stained by ALEXA-555 analyzed by fluorescence microscopy and flow cytometer.The impact of EdU on the growth of ADSCs was examined by trypan blue exclusion，methylthiazoly tetrazoliμM（MTT） assay and assess multiple differentiation potential of ADSC using in vitro osteogenic and adipogenic induction. Results Labeling with EdU in vitro can be easily performed，And labeling stem cells with the concentration of 10μM with 12h is the optimal concentration and time. The optimal concentration and time of labeling has little impact on the growth of ADSC or on the differentiation and can therefore be used for ADSC trading. Conclusion The lebeling method with EdU is simple but efficacious，and the optimal group is labeling with the concentration of 10μM and the time with 12h.

Key words：adipose-derived stem cells；cell therapy； EdU；stem cell labeling；cell tracing

人脂肪干細(xì)胞是存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化的潛能。脂肪干細(xì)胞來源廣泛且易獲取，在臨床上吸脂手術(shù)后廢棄的脂肪數(shù)量巨大，使用酶可以將脂肪干細(xì)胞分離出來[1-2]。脂肪干細(xì)胞應(yīng)用廣泛，其促血管化能力強(qiáng)及具有內(nèi)分泌功能的優(yōu)點(diǎn)可使其廣泛用于細(xì)胞治療、基因治療、組織工程等，現(xiàn)已應(yīng)用于臨床前期體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)[3-4]。為進(jìn)一步研究干細(xì)胞移植后的療效及其原理，對干細(xì)胞行有效的標(biāo)記就顯得尤為重要：通過示蹤的方法，可以直觀得了解移植細(xì)胞在體內(nèi)存活、遷移、分布、增殖、分化、 轉(zhuǎn)歸，得到療效的評價及機(jī)制的推論。可以用來標(biāo)記脂肪干細(xì)胞的標(biāo)記物有跟多種，各有優(yōu)缺點(diǎn)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)中探討的標(biāo)記物EdU為新一代標(biāo)記物，本質(zhì)為核酸類似物，在細(xì)胞分裂增殖的過程中參與到核染色體中達(dá)到標(biāo)記目的[8-9]。本實(shí)驗(yàn)以EdU標(biāo)記脂肪干細(xì)胞，使用流氏細(xì)胞儀精準(zhǔn)檢測其標(biāo)記效率及對標(biāo)記后細(xì)胞行增殖分化能力的測定以獲得優(yōu)化標(biāo)記條件。

1 材料和方法

1.1主要試劑及藥品：低糖DMEM培養(yǎng)基（葡萄糖 1000mg/L，谷氨酞胺4mM/L，HyClone公司，美國），特級胎牛血清（FBS，GIBICO公司，美國），0.25%胰蛋白酶（HyClone公司，美國），平衡鹽溶液（磷酸鹽緩沖液，Phosphatebuffersolution，PBS，HyClone公司，美國），青霉素-鏈霉素溶液（PS，青霉素100U/ml，鏈霉素100ug/ml，Amresco 公司，美國），I型膠原酶 （Sigma公司 美國）二甲基亞礬（DMSO，Amresco 公司，美國），MTT（Sigma公司，美國），鼠抗人單克隆抗體CD45，CD90，CD105，CD44，CD34（購自eBioscience公司） EdU（Invitrogen公司 美國），油紅O，茜素紅（Sigma）。

1.2 ADSCs分離培養(yǎng)和傳代：人脂肪抽吸術(shù)中應(yīng)用10ml注射器接2.0mm吸脂針，無菌狀態(tài)下將脂肪組織離心，去上層脂肪組織，加入終濃度為0.075%的I型膠原酶。37℃恒溫箱，震蕩消化40min。收集最下層細(xì)胞沉淀。1ml完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。加入3ml紅細(xì)胞裂解液并輕輕漩渦顛倒均勻，置于冰上15min，其間輕輕漩渦均勻混懸兩次。并將其置于直徑為6cm的中皿內(nèi)。將培養(yǎng)皿置入體積分?jǐn)?shù)為5%CO2、飽和濕度37℃培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)液，去掉非貼壁細(xì)胞，更換新培養(yǎng)液。以后每3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。每日在相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況。原代細(xì)胞培養(yǎng)7天即可融合傳代。

1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型：取第3代ADSC制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行分裝并行抗體標(biāo)記，每份不少于1×106細(xì)胞。室溫下以CD45-FITC、CD90-FITC、CD105-FITC、CD44-PE、CD34-PE抗體標(biāo)記，IgG-FITC，IgG-PE為同型對照，不標(biāo)記細(xì)胞為空白對照。入流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物。

1.4 EdU標(biāo)記及染色：使用第3代細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。在細(xì)胞狀態(tài)良好時加入EdU并孵育至合適時間，去除EdU，PBS洗凈背景。

對于固定細(xì)胞的染色及檢測：使用96孔板以EdU標(biāo)記細(xì)胞后固定染色。含3.7% 甲醛的PBS固定。并以含0.5% TritonR X-100的PBS破膜，加入染色反應(yīng)液click-iTR，避光、室溫、脫色搖床孵育30min。其中取各實(shí)驗(yàn)組混合細(xì)胞作為對照不染ALEXA-555染料。除去染色反應(yīng)液后，加入背景核染料Hoechst，避光、室溫、脫色搖床孵育30min。PBS清洗3次，4℃保存。熒光顯微鏡觀察。

對于單細(xì)胞懸液的染色及檢測：將標(biāo)記后細(xì)胞收集起來并制成單細(xì)胞懸液。取未標(biāo)記EdU細(xì)胞作為陰性對照，并取各實(shí)驗(yàn)組混合細(xì)胞作為對照，不染ALEXA-555染料。通過流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)率反應(yīng)EdU在ADSC的標(biāo)記率。

1.5 測定EdU對ADSC活性及影響其增殖及分化的程度：根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選擇在12h，24h 時優(yōu)化標(biāo)記濃度即10μM，12h；5μM，24h。進(jìn)行細(xì)胞活性及增殖分化檢測。以0μM，0h作為空白對照，分別行臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)，MTT比色實(shí)驗(yàn)和成脂成骨定向分化實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞活性進(jìn)行測定。定向誘導(dǎo)分化完成后行茜素紅染色及油紅O染色觀察。染色后以倒置顯微鏡觀察鈣結(jié)節(jié)及脂滴生成情況，100倍視野下，分別隨即選取5個高倍視野進(jìn)行計(jì)算，計(jì)算鈣結(jié)節(jié)及脂滴的個數(shù)。多組間比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，標(biāo)記率最高組與其余組比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS 20.0分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADSC細(xì)胞形態(tài)：倒置相差顯微鏡下觀察：原代ADSCs 24h 后即可觀察到少量貼壁細(xì)胞，顯微鏡下細(xì)胞呈小多角形、大小不一，細(xì)胞散在分布，量較少（見圖1），3天后可見大部分ADSCs貼壁（見圖2）。更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)細(xì)胞一般7天可達(dá)80%～90%融合，單個細(xì)胞呈短梭形，核呈橢圓形，核仁清晰，細(xì)胞形態(tài)較一致、整體呈集落樣生長，（見圖3）行傳代培養(yǎng)。原代細(xì)胞傳代后細(xì)胞增殖速度加快，一般2～3 天即可達(dá)80%融合狀態(tài)，可再次傳代（見圖4），傳代細(xì)胞單個細(xì)胞呈短梭形，細(xì)胞形態(tài)較一致，呈一定方向性類成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。P3代細(xì)胞，細(xì)胞排列較整齊，體積較原代稍大。細(xì)胞呈一定順序生長，排列整齊，高倍鏡下立體感強(qiáng)（見圖5）

2.2 人ADSC細(xì)胞表型測定結(jié)果：P3代細(xì)胞約90%以上表達(dá)表面標(biāo)記CD90+，CD105+，CD44+。基本不表達(dá)細(xì)胞表面標(biāo)記CD45+，CD35+。各表面標(biāo)記表達(dá)率表示P3代細(xì)胞基本純化。

2.3標(biāo)記后熒光顯微鏡觀察及不同濃度下脂肪干細(xì)胞的標(biāo)記率：細(xì)胞活性好時加入EdU，圖上可見新分裂的細(xì)胞呈圓形，尚未貼壁生長。加入EdU孵育一定時間后固定染色，以ALEXA-555染色并以Hoechst染背景細(xì)胞。觀察時，在不轉(zhuǎn)換視野的情況下分別以綠色熒光和紫外熒光激發(fā)待檢細(xì)胞?？梢姳籈dU染色的細(xì)胞核為紅色，而全部細(xì)胞核為藍(lán)色。將二者重疊可見藕荷色被標(biāo)記細(xì)胞。其顏色深淺可反應(yīng)染色體中EdU的參與量大?。ㄒ妶D6A、6B、6C）。

單細(xì)胞懸液染色后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果顯示在12h，24h時0μM，5μM，10μM，20μM，50μM濃度的標(biāo)記率如表1。

2.4 EdU對ADSC活性及影響其增殖及分化的程度

2.4.1 臺盼藍(lán)試驗(yàn)：各實(shí)驗(yàn)組結(jié)果比例占總細(xì)胞數(shù)97%以上，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后各數(shù)據(jù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖7）。

2.4.2 MTT比色實(shí)驗(yàn)：將EdU去除后繼續(xù)行細(xì)胞培養(yǎng)，比較標(biāo)記后的細(xì)胞活性大小，每間隔24h行檢測一次，根據(jù)酶聯(lián)免疫檢測儀測定結(jié)果，根據(jù)顯色結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線?？梢娤嗤瑫r間內(nèi)，未標(biāo)記組細(xì)胞量大，以10μM，12h組標(biāo)記的細(xì)胞較5μM， 24h組標(biāo)記的細(xì)胞量大，但都小于未標(biāo)記組（圖8）。

2.4.3成脂分化和油紅O染色：在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，可觀察到細(xì)胞中小脂滴逐漸融合形成大的脂滴，將細(xì)胞核擠向一側(cè)。脂肪分化誘導(dǎo)6天后開始觀察到透亮的小脂滴出現(xiàn)，在2周后達(dá)到高峰， ADSC油紅O染色陽性，油紅O染色后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅染顆粒，誘導(dǎo)2周后成脂分化比例為30%～40%?？瞻孜醇诱T導(dǎo)液組始終未觀察到脂滴的出現(xiàn)。未標(biāo)記EdU組、以10μM，12h標(biāo)記組及以5μM，24h標(biāo)記組出現(xiàn)脂滴數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析每兩組間行t檢驗(yàn)，可見結(jié)果如下：其中，5μM，24h標(biāo)記組與另兩組P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖9、11）。

2.4.4成骨分化和茜素紅染色：成骨誘導(dǎo)的第5天開始，在相差顯微鏡下可觀察到一些ADSC形態(tài)由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)榱⒎綘罨蚨嘟切?，體積增大。在誘導(dǎo)的第l0天左右開始出現(xiàn)小的點(diǎn)狀鈣化斑，在誘導(dǎo)的第14～28天，茜素紅染色可見著紅色的典型鈣化結(jié)節(jié)?？瞻孜醇诱T導(dǎo)液組形態(tài)仍為成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞大小基本不變，偶也可見圓形或多角形細(xì)胞，茜素紅染色均不著色或極弱。未標(biāo)記EdU組、以10μM，12h標(biāo)記組及以5μM，24h標(biāo)記組出現(xiàn)脂滴數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析每兩組間行t檢驗(yàn)，可見結(jié)果如下：其中，10μM，12h標(biāo)記組與另兩組P>0.05，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5μM，24h標(biāo)記組與另兩組P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖10、12）。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推斷使用EdU標(biāo)記人脂肪干細(xì)胞時，以10μM的濃度標(biāo)記12h為優(yōu)化的標(biāo)記方式。

3 討論

3.1 EdU（5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷）是一種胸腺嘧啶核苷類似物[10]，其連有的炔烴基團(tuán)在自然化合物中很少見，能夠在DNA復(fù)制S期時代替胸腺嘧啶（T）滲入正在合成的DNA分子中，最早合成被用作核苷類似物類抗菌藥物[11-13]，近年來，越來越多的被用來檢測DNA復(fù)制及細(xì)胞增殖。EdU參與增殖時插入到正在復(fù)制的DNA分子中，可被顯色劑與EdU發(fā)生共軛反應(yīng)而檢測新合成的DNA[14-15]。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色（BrdU）檢測方法相比，更為方便且對細(xì)胞影響小[16-17]。所以，本實(shí)驗(yàn)預(yù)通過對EdU標(biāo)記ADSC的研究，探求優(yōu)化標(biāo)記濃度及標(biāo)記時間，成為示蹤劑追蹤移植入體內(nèi)的ADSC，觀察其轉(zhuǎn)歸。

3.2 EdU是核標(biāo)記物，相當(dāng)于探針在細(xì)胞分裂時參與DNA的合成而進(jìn)入細(xì)胞[14-15]。標(biāo)記整個細(xì)胞的過程與細(xì)胞增殖活性有關(guān)，而染色率與細(xì)胞活性有關(guān)，活性高者細(xì)胞分裂增殖快，相同時間內(nèi)染色率高，活性低者或細(xì)胞量多進(jìn)入平臺期者細(xì)胞分裂增殖慢，相同時間內(nèi)染色率低[18-19]。故選取狀態(tài)優(yōu)良且為對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記時間選取細(xì)胞倍增時間，濃度則需要多次嘗試。過高的濃度或過長的時間將導(dǎo)致狀態(tài)不良的細(xì)胞死亡。

3.3 EdU標(biāo)記方法的探討：理想的細(xì)胞標(biāo)記物除標(biāo)記率高外，需對細(xì)胞的增殖分化也無影響。雖然EdU分子量小，對細(xì)胞影響較小，但高濃度或長時間標(biāo)記會影響細(xì)胞的代謝及增殖分化。EdU是新一代細(xì)胞核標(biāo)記物，用DMSO或去離子水溶解為儲存液時，二者的標(biāo)記性質(zhì)發(fā)生了改變，以DMSO溶解者，染料標(biāo)記細(xì)胞核時擴(kuò)散作用明顯，可以提高細(xì)胞標(biāo)記率。但DMSO將影響細(xì)胞的增殖分化及體內(nèi)過程。而以去離子水溶解者，染色后對細(xì)胞活性影響較小，但是影響其標(biāo)記率，需要通過增加標(biāo)記時間或濃度提高標(biāo)記率[20]。

標(biāo)記時，將傳代的細(xì)胞孵育過夜后再行細(xì)胞標(biāo)記，配置2倍濃度的EdU待用，去除一半培養(yǎng)基后將2倍濃度的培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿中孵育。使細(xì)胞保持局部微環(huán)境使其影響變小。也有助于EdU在培養(yǎng)基中混合均勻。

一些細(xì)胞在標(biāo)記后形態(tài)有所改變，細(xì)胞變寬，變大，核染色較深。其原因可能與有機(jī)溶劑DMSO有關(guān)，DMSO是在低溫凍存下細(xì)胞穿透性的保護(hù)劑，常溫下有機(jī)溶劑具有細(xì)胞毒作用。隨標(biāo)記濃度的增加，細(xì)胞形態(tài)改變也逐漸明顯，甚至細(xì)胞死亡數(shù)量增加，在這些可能與DMSO濃度增加有關(guān)。這也與國外報道的DMSO具有細(xì)胞毒作用，且濃度及時間依賴性相一致。

3.4 EdU對細(xì)胞損害原因探討：在流式細(xì)胞檢測過程中，相同細(xì)胞量細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的EdU染色相同時間后從培養(yǎng)皿上消化下來制成單細(xì)胞懸液進(jìn)行檢測，可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞量有變化，濃度高者細(xì)胞量少，證明經(jīng)染色后細(xì)胞有部分死亡現(xiàn)象。其死亡率與染色濃度成正比。分析其原因可能為：①染料對細(xì)胞的毒性作用；②有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性作用；③因培養(yǎng)皿上細(xì)胞的濃度不同，使細(xì)胞消化，離心的操作對細(xì)胞的損耗不一。

3.5 對ADSC的討論： EdU標(biāo)記的原理是作為核苷類似物在細(xì)胞增殖時參與到新合成細(xì)胞的染色體內(nèi)標(biāo)記細(xì)胞。在體內(nèi)反應(yīng)微弱的遷移增殖變化時，效果最優(yōu)，在研究組織器官的動力學(xué)方面效果優(yōu)于其他染料。目前對干細(xì)胞定義的理論眾說不一[21-22]，酶消化法提取的ADSC中經(jīng)傳代純化后的細(xì)胞里真正含有干細(xì)胞來源的細(xì)胞量較少。一些理論認(rèn)為干細(xì)胞為性質(zhì)較穩(wěn)定的細(xì)胞，細(xì)胞長期處于靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)受到信號刺激時才會增殖[22-23]。體外培養(yǎng)時，在一定的標(biāo)記時間內(nèi)當(dāng)干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)時，則被標(biāo)記的細(xì)胞將不是干細(xì)胞性質(zhì)的，研究單純的標(biāo)記率也就失去了意義。

3.6 經(jīng)EdU標(biāo)記后的ADSC的增殖及轉(zhuǎn)化情況也很重要。經(jīng)標(biāo)記后的細(xì)胞最終要轉(zhuǎn)移到體內(nèi)進(jìn)行示蹤，理想的示蹤劑須對被標(biāo)記細(xì)胞的增殖和分化無任何影響。但是活細(xì)胞的增殖及分化過程對外環(huán)境要求苛刻，容易受到外環(huán)境的影響。幾乎所有的示蹤劑都會干擾細(xì)胞正常的生理狀態(tài)，影響其增殖分化。我們通過降低細(xì)胞的標(biāo)記濃度及標(biāo)記時間，在較小的影響細(xì)胞增殖的情況下達(dá)到最大的標(biāo)記率。我們行MTT實(shí)驗(yàn)，以不標(biāo)記的正常細(xì)胞作為對照，96孔板觀察細(xì)胞的增殖情況。得出在10μM及12h的標(biāo)記組合時，其細(xì)胞增殖的曲線與對照組增殖的曲線較近。對細(xì)胞的影響較小，優(yōu)于其他組細(xì)胞。在定向分化的比較中，得到相同結(jié)論，說明10μM時，不僅標(biāo)記率高，且對細(xì)胞的影響也小，從而得到優(yōu)化的標(biāo)記率。體外狀態(tài)與體內(nèi)狀態(tài)有不同程度的差異，今后，需要大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)EdU標(biāo)記的ADSC在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程，是否影響體內(nèi)ADSC的代謝情況。并努力尋找對細(xì)胞活性影響更小的標(biāo)記物。

4 結(jié)論

EdU標(biāo)記方法簡單，需時間短，標(biāo)記率高，作為探針標(biāo)記精確，特異性強(qiáng)，適合干細(xì)胞的示蹤標(biāo)記。臺盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)，MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)10μM，12h 和5μM，24h 組合標(biāo)記的脂肪干細(xì)胞在影響細(xì)胞增殖方面無明顯差別。定向分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了10μM，12h 組合標(biāo)記方法對細(xì)胞分化影響較小。本實(shí)驗(yàn)篩選出干細(xì)胞標(biāo)記的優(yōu)化標(biāo)記濃度和標(biāo)記時間組合即10μM，12h，且標(biāo)記率能達(dá)到90%以上。為進(jìn)一步測試體內(nèi)細(xì)胞標(biāo)記率奠定了基礎(chǔ)。

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