扁平疣患者人乳頭瘤病毒基因型的檢測分析

[摘要]目的：探討四川地區(qū)扁平疣皮損組織中人乳頭瘤病毒（HPV）基因型的感染情況。方法：采用核酸分子快速導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)，對92例扁平疣患者皮損組織進(jìn)行HPV感染分型的檢測。結(jié)果：92份扁平疣皮損標(biāo)本中HPV陽性88例，檢出率是 95.65%；檢測出5種HPV亞型，各型別檢出率由高到低依次是HPV11，HPV18，HPV6，HPV59，HPV58。其中單一感染陽性率達(dá)到 60.86%，多重感染達(dá)到 34.78%。二重感染檢出率由高到低為： HPV11和HPV18 ，HPV11和HPV6， HPV11和HPV59。有2例為三種感染，均為 HPV6、HPV11和HPV59。結(jié)論：四川地區(qū)扁平疣患者以低危型HPV11感染為主，高危型HPV感染多以混合感染的形式存在。

[關(guān)鍵詞]扁平疣；人乳頭瘤病毒；基因型

[中圖分類號]R739.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0069-02

Detection and analysis of Human Papillomavirus Genotype in Patients with Flat Warts

LIN Xin-yu1， CHEN Jing-yu2，WANG Fang1， LIAO Heng-li1，LIN Min3

（1.Department of Dermatology，Sichuan Academy of Medical Sciences Sichuan Provincial People's Hospital，Chengdu 610072，Sichuan，China；2.Department of Dermatology，The Sixth People's Hospital of Chengdu；3.Department of Clinical Laboratory，Sichuan Academy of Medical Sciences Sichuan Provincial People's Hospital）

Abstract： Objectives To study the infection and the distribution of the Human papillomavirus（HPV） DNA in Flat Warts specimens in Sichuan territory. Methods Ninety-two samples from patients with Flat Warts were examined for the identification of HPV genotypes with flow-through hybrization and gene chip. Results Of the ninety-two patients studied，eighty-eight cases were positive，the total positive rate was 95.65%.Five genotypes were found by HybriMax in total twenty-one HPV genotypes in ninety-two clinic samples； the most positive percentage of various subtypes of HPV was HPV11，followed by HPV18， HPV6， HPV59 and HPV58. The positive rate of single subtype infection of HPV was 60.86%，the positive rate of multiple subtypes infection of HPV was 34.78%. The most positive percentage of two subtypes infection of HPV was HPV11and HPV18，followed by HPV11 and HPV6， HPV11 and HPV59. And three different HPV subtypes infection（HPV6、HPV11and HPV59）were detected in two samples. Conclusions Our results indicate that HPV11 is the most prevalent HPV subtype of Flat Warts in Sichuan territory， high-risk HPV genoytpes exist mainly in multiple subtypes infection.

Key words： Flat Warts ； human papillomavirus；genotype

扁平疣好發(fā)于青少年顏面和手背等處，是一種由人乳頭瘤病毒（human papillomavirus， HPV） 感染表皮所致的良性增生物，病程慢性。部分患者病情頑固，尤其是在免疫力缺陷的患者，疣體很少自然消退[1]。HPV 是一種小分子雙鏈 DNA 病毒， 對人皮膚、粘膜有高度親嗜性，根據(jù)其基因序列的多態(tài)性目前已發(fā)現(xiàn) HPV 有 100 余種臨床亞型[2]。目前關(guān)于扁平疣治療方面的文章較多，但關(guān)于扁平疣患者HPV感染基因型的報道很少。導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)是近年來檢測 HPV 亞型的一門新技術(shù)， 可同時一次性檢測到 21 種 HPV DNA 的基因型，本文擬通過該基因芯片分型技術(shù)來檢測92例四川地區(qū)扁平疣患者皮損中的 HPV DNA，以探討該地區(qū)扁平疣HPV基因型的感染狀況和HPV 基因型的分布特點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1病例選擇：92例份標(biāo)本均來自本院2010年10月～2012年10月門診扁平疣患者， 標(biāo)本采集前均由醫(yī)師征得患者的知情同意。男40例，女52例；年齡10～47歲，平均33.7歲； 皮疹分布于顏面及手背，病程2個月～4年，平均6.8個月；均未發(fā)現(xiàn)伴有影響免疫系統(tǒng)的疾病。

1.2 標(biāo)本采集：常規(guī)消毒，采集疣體組織置于專用滅菌管中，凍存于-20℃待檢。

1.3 儀器與試劑：雜交儀（凱普醫(yī)用核酸分子快速雜交儀），PE 9600 PCR儀，隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），臺式高速離心機(jī) （Thermal），超凈工作臺（Heal Force）。人乳頭瘤病毒（HPV）分型檢測試劑盒（凱普）：包括DNA提取試劑盒；HPV基因分型檢測試劑盒-PCR試劑盒；HPV基因分型檢測試劑盒-雜交試劑盒。

1.4 HPV基因分型檢測：采用 HybriMax 技術(shù)檢測 21 種 HPV 亞型（包括 HPV6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、56、58、59、68、53、66 和 CP8304）。

實(shí)驗(yàn)步驟：樣本HPV DNA提取， PCR擴(kuò)增，核酸分子快速導(dǎo)流雜交，結(jié)果判讀，按芯片上HPV亞型分布的相應(yīng)著色位點(diǎn)判斷。檢測結(jié)果陽性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色圓點(diǎn)。根據(jù)膜條HPV分型分布圖，判斷陽性點(diǎn)為何種HPV病毒類型。多個圓點(diǎn)陽性即為多重感染，每張芯片設(shè)有 PCR 反應(yīng)質(zhì)控點(diǎn)和雜交顯色質(zhì)控點(diǎn)各一個。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用 SPSS11.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

2 結(jié)果

2.1 HPV DNA的基因型檢測結(jié)果：本研究所有病例標(biāo)本92例中，有 88例檢測出 HPV DNA 的基因型，檢出率是 95.65%；其中高危型感染陽性率達(dá)到 52.18%，低危型感染陽性率達(dá)到 80.43%。所有能檢測的 21 種HPV基因型中，檢測出5種HPV基因型，檢出率從高到低依次為：HPV11，HPV18， HPV6，HPV59和 HPV58，未發(fā)現(xiàn)HPV16、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53 、56、66、68及CP8304 型的感染。92例扁平疣患者HPV基因型檢測的結(jié)果見表1。

2.2 HPV單一及多重感染情況分析：92 例扁平疣患者中檢測出 HPV基因型陽性者 88 例，88例 HPV DNA 陽性樣本中，HPV單一型感染56例，單一感染率是 60.85%，有32例存在2～3種亞型的感染，二重感染出率是32.60%，三重感染檢出率為2.17%，多重感染率達(dá)到34.77%。高危型/低危型存在混合或交叉感染，其中以HPV11和HPV18 的二重感染最多見，其次為HPV11和HPV6， HPV11和HPV59。有2例為三種感染，均為 HPV6、HPV11和HPV59。高危型 HPV59均以混合感染形式存在，未發(fā)現(xiàn)單一 感 染 。高危型 HPV58均以單一感染形式存在，未發(fā)現(xiàn)混合感染。92例扁平疣患者HPV單一及多重感染情況見表2。

3 討論

人乳頭瘤病毒能引起人類皮膚和黏膜的增生性病變，HPV 按基因組的不同可分為若干型， 當(dāng)分離株病毒的 L1 基因與已知序列近源病毒株同源性<90%時，則可定為新的型別[3]。不同型別的HPV的致病能力有很大差異，依據(jù)HPV引起的增生性病變是否致癌，可將其分為低危型和高危型兩大類。韓國學(xué)者檢測了30例扁平疣患者的皮損標(biāo)本，有29例為HPV3感染，1例為HPV94感染所致[4]，國內(nèi)余元勛也報道扁平疣主要由高危型的HPV3型引起[5]。也有國外學(xué)者報道扁平疣主要由HPV1型引起[6]。扁平疣合并其他疾病的患者有不同類型病毒的感染，有學(xué)者在腎移植患者的扁平疣標(biāo)本中檢測出HPV49感染[7]，在急性淋巴細(xì)胞白血病患者的扁平疣標(biāo)本中檢測出HPV126感染[8]。HPV基因芯片分型是目前最先進(jìn)的檢測技術(shù)，它將基因擴(kuò)增技術(shù)、導(dǎo)流雜交技術(shù)及基因芯片技術(shù)結(jié)合起來，利用了PCR技術(shù)高靈敏性、導(dǎo)流雜交技術(shù)的高特異性和基因芯片的高通量性特點(diǎn)，本研究應(yīng)用基因芯片分型技術(shù)檢測扁平疣皮損中的HPV DNA，可同時一次性檢測到21種HPV的基因型，包括HPV6、11、42、43、44等5種低危型； HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等13種高危型以及HPV53、66和CP8304等3種中國人特有的中危型。通過對92例扁平疣皮損標(biāo)本的HPV基因分型檢測，本研究有如下發(fā)現(xiàn)：1.扁平疣皮損中HPV基因型以低危型為主，本研究中，HPV基因型的檢出率是95.66%，所有檢測的 21 種基因型中，扁平疣皮損涉及的HPV亞型的種類較少，僅檢出5種。尖銳濕疣皮損HPV亞型的種類較多，有學(xué)者檢出18種[9]，有學(xué)者檢出10種[10]。本研究HPV檢出率從高到低依次為：HPV11，HPV18， HPV6，HPV59，HPV58，其中高危型感染陽性率達(dá)到 52.18%，低危型 80.43%。高危型別涉及HPV18、58和59型。低危型別涉及HPV6和11型。說明扁平疣主要感染的HPV基因型以低危型HPV6、11為主，其中以HPV11為明顯優(yōu)勢；但由于本研究未能檢測所有的HPV亞型，無法確定以往關(guān)于扁平疣研究中所檢測到的HPV亞型是否也是四川地區(qū)的優(yōu)勢亞型。2扁平疣皮損中多重感染發(fā)生率高：本研究發(fā)現(xiàn)扁平疣組織中存在HPV高一低危型、低一低危型兩種不同形式的多重感染。多重感染率高達(dá)34.79%，其中二重感染最多。本文還顯示低危型HPV11半數(shù)以上參與混合感染，其混合感染率為53.33%；高危型HPV18、HPV59也主要以混合感染形式存在，混合感染率達(dá)到54.54%。與尖銳濕疣皮損的研究結(jié)果相近[9]。

綜上，通過對扁平疣組織HPV基因型的檢測可以了解患者所感染的病毒類型，為治療方案的選擇提供參考，還可為HPV 疫苗的研制提供依據(jù)，但由于本研究樣本量相對較少，且患者多來自四川地區(qū)，而人乳頭瘤病毒的感染有一定的地域差異性，需在今后的工作中擴(kuò)大樣本量做更深入廣泛的研究。

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