顆粒脂肪體外處理方法對其存活質量影響的研究進展

自體顆粒脂肪移植是指通過吸脂手術將患者身體某部位多余的皮下脂肪組織吸出，經過純化、藥物等相關處理后選擇完整的顆粒脂肪通過注射的方式移植到需要進行脂肪填充的部位，以治療軟組織缺損或組織容量不足所導致的功能障礙和形態(tài)不美，包括面部萎縮、乳房增大、豐唇等。而用自體顆粒脂肪填充軟組織的缺損或者容量不足，較傳統(tǒng)的填充物質如透明質酸化合物等更接近于人體，不但降低了感染率，避免了免疫反應及排異反應的發(fā)生，而且脂肪顆粒組織來源豐富，容易獲得，手術創(chuàng)傷小，因而術后并發(fā)癥發(fā)生率大大降低。

1 顆粒脂肪移植的發(fā)展歷史

1893，Neuber等[1]首次報道用自體脂肪修復組織缺損。1911年，第一次有人嘗試注射自體脂肪在皮下組織以達到增大乳房的效果。1950年，Peer等的研究表明自體脂肪移植成活率可高達50%。20世紀70年代，脂肪抽吸技術廣泛應用，自體脂肪移植開始在國內外得到認可。20世紀80年代，隨著吸脂技術的改進，腫脹麻醉的出現，這個技術更加普及于臨床。1985年，Illouz and Fournier運用注射器抽吸脂肪后直接進行自體脂肪移植，具有操作簡易的優(yōu)點，被Illouz稱為“microlipoinjection”。這個過程讓脂肪移植修復軟組織缺陷及萎縮更加簡便。上世紀80年代，Loeb ，Bircoll，Chajchir，Gonzalez ，Pereira建立了脂肪移植的安全參數。1998年，Coleman用離心的方式純化抽脂的脂肪顆粒，創(chuàng)建了Lipostructure移植技術即Colemans技術，提出要保證移植的脂肪細胞的完整性及其成活能力[2]。2001年，ZuK和他的研究團隊發(fā)現并證實，抽脂術獲得的脂肪組織中存在一群具有多項分化潛能、間充質來源的成體干細胞：脂肪源性干細胞（Adipose-derived stromal/stem cells，ASCs），隨著對脂肪源性干細胞的研究，不少研究人員表明ASCs具有來源豐富、取材容易、增殖迅速、多項分化潛能、低免疫原性和免疫調節(jié)作用。將脂肪源性干細胞與脂肪組織一起應用于臨床，在再生醫(yī)學領域有著廣闊的應用前景。2009年，日本東京大學醫(yī)學院整形外科吉村浩太郎首次提出自體細胞輔助脂肪移植技術[3]（Cell-Assisted Lipotransfer，CAL），簡稱CAL技術，即將自體脂肪來源干細胞（adipose stromal cells，ASCs）與脂肪細胞混合，聯合注射。CAL技術于2003年應用于臨床至今，已取得了良好的效果，為組織缺陷及萎縮的修復再創(chuàng)一項技術。

2 可能影響顆粒脂肪存活的因素

自體脂肪移植已成為當前修復軟組織缺陷最有前景的方法，脂肪移植術后效果如何取決于移植脂肪細胞的活性及其在受區(qū)的存活能力，國內外許多學者在脂肪移植的成活機制、提高脂肪移植后成活率及改進軟組織修復效果等方面做了大量的臨床及基礎研究，有些已取得突破性進展。影響顆粒脂肪存活的因素有很多，包括移植脂肪獲取的方法，脂肪移植的供區(qū)及受區(qū)的選擇，抽吸的壓力，吸脂的技術，顆粒脂肪注射方法，輔助藥物的應用（生長因子、激素、維生素E）全身因素等，國外有學者提出如果注入大量脂肪顆粒后必須注意以下幾點[4]：①抽脂時必須控制負壓壓力（低壓范圍：35～50kPa），防止高壓抽脂，1990年，Nguyen提出高負壓吸引法獲取的顆粒脂肪接近90%脂肪細胞膜破裂、拉長、變形，僅少部分細胞保持完整形態(tài)，而剪碎法和注射器法獲取的顆粒脂肪僅10%被破壞；②使用適當的器械，如：壓力表及注射針頭的應用，不僅簡化了手術過程，而且提高了脂肪的成活率；③移植部位避免活動1周；④常規(guī)抗生素1～2周；⑤移植部位可用光療；⑥塑身衣塑形1～2周。而本文主要探討顆粒脂肪獲取后的不同體外處理方法對其活力的影響。

2.1體外顆粒脂肪不同純化方式對其活性的影響：顆粒脂肪純化的主要目的是去除多余的腫脹液，其含有利多卡因、腎上腺素等藥物，國內有研究證實利多卡因及1/500000腎上腺素均能夠明顯抑制脂肪顆粒的活性[5]，同時去除脂滴及其混雜于脂肪中的纖維組織碎塊，徹底去除其中的小凝血塊。具體方法是將裝有顆粒脂肪組織的50ml注射器置于試管架上，反復加入生理鹽水后靜置沉淀并用長針挑除纖維條索及灰白色脂肪粒，排去下層水分，然后置于離心機中離心，收集中間層顆粒飽滿純黃色顆粒脂肪備用。Hlow、Chajchir認為，在脂肪移植中，純化抽吸所得的顆粒脂肪組織是必不可少的步驟，離心后去除多余的腫脹液、纖維條索、失活脂肪粒及脂滴能提高脂肪顆粒的數量及質量。盡管脂肪組織抽吸后純化處理是非常重要的，但是過多繁瑣的處理會不會影響脂肪組織的活性和移植后的成活率，特別是會不會在繁雜的處理過程中增加病原菌污染的可能性，那么是否可以通過其他更為簡便的處理方法既減少了操作步驟又達到了純化處理的效果，同時還可避免增加病原菌污染的可能。最近有國內外的學者提出，供移植使用的顆粒脂肪純化的方法可以適當簡化，目前應用最多的為靜置法及離心法[6]。還有學者也提出對其不進行任何處理直接用于移植。

離心法是將脂肪顆粒混合物經過離心后去除下層多余腫脹液及上層脂滴，收集中間層顆粒飽滿、黃色的顆粒脂肪進行移植。該方法純化程度高，可以去掉大部分多余液體及油滴，使獲得的脂肪顆粒更加純凈。有學者用錐蟲藍活性測定法及血細胞計數器對不同處理組的脂肪顆粒進行了研究，證明在適當的離心率（1000r/m）下離心或者經過生理鹽水洗滌后的脂肪顆粒純度及活性顯著提高，而離心組與生理鹽水洗滌組的差異并不明顯 [7]。但是，目前學術界認為該方法對脂肪細胞有一定損傷的觀點占大多數，國內外都有學者對不用離心力作用下的脂肪顆粒葡萄糖轉移量進行了研究，發(fā)現無論是高速離心還是低速離心，脂肪顆粒的葡萄糖轉移量均減少，說明離心對脂肪顆粒的活性有一定程度的損害，并發(fā)現隨著離心力的增大，顆粒脂肪的葡萄糖轉移量逐漸減少[8-9]。故有些學者認為，靜置法更優(yōu)于離心法，靜置法不但可以去除水分等雜質，更能最大程度地保護脂肪顆粒的活力[10]。

靜置法主要是將顆粒脂肪靜置1h，可見脂肪混合物分為上、中、下三層，去除上層脂肪細胞所釋放出的橘黃色脂滴及下層粉紅色的液體，收集中層顆粒飽滿黃色顆粒脂肪備用。此方法目前應用較多，Kurita 等[11]通過研究后認為離心速度過快對脂肪源性干細胞和前脂肪細胞的完整性都有一定程度的破壞。靜置后獲得的脂肪細胞活性比離心后獲得的脂肪細胞活性更好，靜置懸浮法不但可以排除多余的水分等雜質，而且更大程度地保護了脂肪顆粒的活性，省去了顆粒脂肪洗滌步驟，減少了手術過程中對其可能的損傷及其污染。Rose等[12]將靜置、洗滌及離心后所得顆粒脂肪組織進行碘酸 - 希夫染色分析，發(fā)現靜置法所得顆粒脂肪組織細胞完整性均較洗滌及離心所得的好，但是同時也證實靜置法純化率低，時間長，析出雜質也不完全。Paul等[13]將注射器抽吸的脂肪顆粒與吸脂機抽吸脂肪顆粒分別按體外不同處理方法分為：①不做任何處理組；②500g離心2min組；③林格氏液洗滌組；④生理鹽水洗滌組；⑤林格氏液洗滌后500g離心2min組；⑥生理鹽水洗滌后500g離心2min組。將各組處理后的脂肪顆粒分別注入裸鼠背部皮下，12周后取材進行重量、活性及組織學觀察分析，認為各組之間重量、活性及組織學觀察并無明顯統(tǒng)計學差異。雖然裸鼠實驗表明了各種處理方法后的脂肪組織在重量、活性及組織學方面無明顯差異，但是我們認為靜置的方法相對于其他處理方法不但可以去除多余的腫脹液及脂滴，而且減少了操作步驟，這樣既可以保護脂肪組織移植后的活性又減少了手術操作中病原菌污染的幾率。但是靜置法具有純化率低、不能完全去除多余的腫脹液、需時較長等缺點。

2.2 顆粒脂肪的體外保存：自體顆粒脂肪移植在臨床應用中，根據需要有時需要分次移植或者少量多次移植，特別是脂肪源性干細胞的發(fā)現并應用于臨床后，更增加了抽取脂肪的量和時間，這無疑增加了顆粒脂肪體外停留的時間。如果顆粒脂肪在體外能夠得到很好的保存而不喪失其絕大部分活力，一次吸取大量顆粒脂肪后在不影響其活力的情況下分次移植，或移植手術分次完成，這樣不僅減少患者痛苦、手術室占用時間、醫(yī)療的風險及費用，還可減輕醫(yī)生的勞動負荷。因此，如何保護和提高顆粒脂肪在體外停留移植前的活性顯得非常重要。

一般而言，對于體外顆粒脂肪的保存，多數學者采取低溫存儲的方法，包括普通冰箱、低溫冰箱及液氮罐的冷藏，早在1990年，Fouriner等就提出了冷凍后的脂肪組織移植效果與新鮮組織移植效果無明顯的差異，隨后許多學者在脂肪顆粒低溫保存這一問題上提出了自己的觀點，Atik[14]將體外的脂肪顆粒用冷凍干燥、甘油浸入及液氮三種方法保存相同時間后移植于小鼠頭皮下，一段時間后取材進行組織學檢測，甘油浸入及冷凍干燥保存的脂肪顆粒均出現了較多的空泡及纖維變性區(qū)域，脂肪細胞明顯減少，而液氮保存的脂肪顆粒和新鮮脂肪顆粒組織學形態(tài)相近。

由于為獲取更好活性的脂肪顆粒，吸脂需用細管、低負壓下進行，手術時間較長，特別是脂肪源性干細胞的應用，增加了提取脂肪來源干細胞需要的時間。另外，由于富集干細胞需cGMP標準的實驗室，這有可能導致提取細胞和手術室不在同一單元，這無疑又增加了標本轉運的時間，如何在這期間保護顆粒脂肪的活力就顯得非常重要。Yoshinura等[15]將吸脂所得的顆粒脂肪在室溫保存1、2、4、24h，4℃保存0、1、2、3天和-80℃保存1個月后進行組織形態(tài)學、油脂比例、GPDH活性及提取脂肪來源間充質干細胞（ASCs）的效率進行比較，認為室溫保存下24h脂肪細胞破壞較前4個小時增大明顯，4℃保存隨著時間的增加脂肪源性間充質干細胞提取效率降低。Erdim[16]對不同溫度下保存體外脂肪顆粒展開研究，發(fā)現4℃是脂肪存儲最適合的溫度，其活性與新鮮脂肪顆?；钚韵喈?，而-20℃及-80℃存儲的脂肪顆?；钚跃档?。同時，對于其他溫度的保存也有學者提出自己的觀點，Oren等[17]就提出-80℃保存顆粒脂肪組織，他們將洗滌去除多余水分及脂滴的顆粒脂肪后放入-80℃冰箱保存2周，2周后室溫1h融化后注入裸鼠皮下，對照組為將洗滌、去除多余水分及脂滴的顆粒脂肪立即注射入裸鼠皮下，15周后處死裸鼠取材，發(fā)現實驗組及對照組在重量、體積及組織學參數方面均無明顯統(tǒng)計學差異，該實驗認為-80℃可以保存顆粒脂肪組織2周。

4℃冰箱保存脂肪組織的方法被大多數學者認可，對顆粒脂肪移植的臨床應用具有實際意義。這種方法不但可以保證移植后脂肪組織的活力，而且為脂肪源性干細胞應用于臨床提供了更加便利的條件，但是其他溫度條件下的低溫保存，例如：0℃、液氮中保存或者是否應用添加低溫保護劑后低溫保存顆粒脂肪組織并無權威的說法，仍有待于進一步研究。

3 添加細胞因子或干細胞對其存活的影響

3.1生長因子：生長因子在顆粒脂肪移植中可能的作用最早受到關注。許多學者認為移植脂肪顆粒時適當加入生長因子，可以提高顆粒脂肪移植的成活率。目前，對生長因子研究較多的是血管內皮細胞生長因子（VEGF），另外也有關于瘦素、堿性成纖維細胞生長因子、成纖維細胞生長因子-2、促紅細胞生成素等對顆粒脂肪移植成活率的研究報道。

VEGF是促進血管生成的重要因子，研究證明將VEGF轉染在脂肪源性干細胞上可以提高脂肪移植物的活力及質量，該實驗將DiI標記的VEGF轉染的脂肪源性干細胞+脂肪混合物、DiI標記的脂肪源性干細胞+脂肪混合物、胰島素+脂肪混合物、單純培養(yǎng)基+脂肪混合物，分別注射在裸鼠皮下，相同時間后取材進行組織學分析，發(fā)現前兩組脂肪壞死及纖維化較少，DiI標記的VEGF轉染的脂肪源性干細胞+脂肪混合物的毛細血管密度較其他組高 [18]。Yi等[19]的研究也證實了VEGF可以提高顆粒脂肪移植的活性及質量。他們將腺病毒介導的VEGF和脂肪移植混合物、腺病毒介導的蛋白基因和脂肪混合物、脂肪混合物和生理鹽水移植于裸鼠皮下，進行組織學分析后得出上述結論。

瘦素（leptin）是一種由脂肪組織分泌的激素，人們之前普遍認為它進入血液循環(huán)后會參與糖、脂肪及能量代謝的調節(jié)，促使機體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成。王友彬等[20]實驗證實瘦素對顆粒脂肪移植的活性有促進作用，由于血管內皮細胞上有瘦素的受體，是瘦素的靶細胞之一，瘦素可以促進血管內皮細胞增殖，加快局部血管增生、增加局部血供，促進了顆粒脂肪的活性。瘦素還可使前脂肪細胞向脂肪細胞分化。國內外的研究都表明生長因子及瘦素的應用有利于脂肪組織的生長，但是該方面國內臨床應用病例較少，是否存在潛在風險和具有明確的臨床效果還有待進一步觀察。

3.2 富血小板血漿：富血小板血漿簡稱為PRP，是一種經由自體全血離心處理后，得到的富含高濃度血小板源性生長因子的血漿。PRP是否能提高脂肪顆粒的成活率倍受國內外學者們的關注。Por等[21]對PRP能否提高顆粒脂肪移植成活率做了研究，他們將患者的顆粒脂肪和PRP 4：1混合注射入裸鼠皮下，將顆粒脂肪和生理鹽水4：1混合作為對照注射于裸鼠皮下，16周后取材，結果顯示兩組重量、體積及組織學參數在統(tǒng)計學上均沒有顯著差異。但是Oh等[22]做了和Por相同的實驗，即將脂肪顆粒與凝血酶和氯化鈣激活的PRP混合（PRP組）注射于裸鼠頭皮模型，對照組用生理鹽水和脂肪顆?；旌?，10周后取材。他們發(fā)現PRP組脂肪移植的體積和重量明顯高于對照組，組織學觀察也發(fā)現PRP組的囊腫、空泡、纖維增生明顯少于對照組，但是細胞的完整性和炎癥之間兩組無統(tǒng)計學意義。Oh等認為產生不同結果的原因是Por等并沒有加入激活物，而且PRP的制備也不同。Kevin 等對448例在自體脂肪移植中添加PRP的患者及132例未使用PRP的患者進行隨訪調查，發(fā)現使用了PRP組患者移植區(qū)術后瘀血及水腫明顯減輕[23]。關于PRP是否能提高顆粒脂肪移植后的成活率，不同學者均有各自的說法，但是PRP作為富含高濃度血小板，具有多種生物因子，能促進細胞的黏連生長，改善外周血管，促進細胞的更新，可能對顆粒脂肪移植后的生長有一定的促進作用。

3.3脂肪源性干細胞（ASCs）：隨著2001年，ZuK和他的研究團隊發(fā)現并證實，抽脂術獲得的脂肪組織中存在一群具有多項分化潛能、間充質來源的成體干細胞-脂肪源性干細胞（Adipose-derived stromal/stem cells，ASCs），并且將其應用于臨床。目前，國內外學者開始將更多的注意力放在ASCs對脂肪移植存活的影響上來。2009年，日本學者吉村浩太郎提出自體細胞輔助脂肪移植技術（Cell-Assosted Lipotransfer，CAL），簡稱CAL技術，即將抽吸所得的自體顆粒脂肪分成兩份：一份用于患處的填充，另一份經膠原酶消化，離心后分離出多種細胞的混合物稱基質血管成分（Stromal Vascular Fraction，SVF），其中含有大量的ASCs，吉村浩太郎將兩部分共同注射于受體，含有豐富的ASCs的SVF粘附在脂肪顆粒上，不僅ASCs可以分化成脂肪細胞，促進脂肪再生，還可以促進血管化的作用，營養(yǎng)脂肪細胞。提高了脂肪細胞的數量，增加了脂肪細胞移植的成活率。根據吉村浩太郎的報道[24]，40名受試患者中僅有4名出現了纖維囊或者鈣化，其余患者均表示滿意。雖然ASCs在顆粒脂肪移植過程中的應用有利于顆粒脂肪移植后的活性，優(yōu)化了移植后的效果，但是隨之也帶來了相關潛在風險，從干細胞產品的管理、運輸、病原菌的防治，甚至相關試劑的使用等均存在尚未解決的問題，仍需要進一步研究和解決，但是ASCs的發(fā)現和臨床應用將傳統(tǒng)的顆粒脂肪移植提高到了一個新的層面，展現出了更加廣闊的應用前景。

4 小結

綜上所述，自體脂肪移植已經成為當前軟組織凹陷充填和美容為目的的軟組織增大的理想方法之一，但是移植脂肪細胞的活性及其在受區(qū)的存活率均影響著移植手術后的效果。雖然國內外學者對于如何體外處理顆粒脂肪以提高存活率仍有爭議，并且生長因子、PRP等是否可以提高脂肪組織的存活率還處在實驗階段，臨床病例報道相對較少，而ASCs的添加又牽扯到干細胞的臨床轉換應用的諸多問題，但是我們相信隨著進一步的研究和探索，自體脂肪移植會有更加廣闊的前景，將成為整形外科領域一項不可缺少的技術。

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