自體髂骨復(fù)合PRF修復(fù)牙槽嵴裂的實驗研究

[摘要]目的：將富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF）應(yīng)用于牙槽嵴裂植骨手術(shù)，驗證其是否能夠減少植骨術(shù)后的骨吸收。方法：8～12月齡犬8只，以外科手術(shù)的方法制備雙側(cè)牙槽嵴裂模型，隨機于兩側(cè)同期植入自體髂骨（對照組）及自體髂骨混合PRF（實驗組）。于術(shù)后當(dāng)日、2個月、4個月時拍攝上頜骨CT，利用三維重建軟件測量植骨區(qū)體積，計算骨吸收率。結(jié)果：術(shù)后2個月、4個月時實驗組的骨吸收率明顯小于對照組，行配對樣本的t檢驗，P<0.01。結(jié)論：將PRF加入自體髂骨進行骨移植修復(fù)犬的牙槽嵴裂，在術(shù)后4個月的時間范圍內(nèi)，可以減少術(shù)后的骨吸收。

[關(guān)鍵詞]富血小板纖維蛋白；牙槽嵴裂植骨；三維重建；骨吸收率

[中圖分類號]R782 [文獻標(biāo)識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）01-0024-02

Experimental study on autologous iliac bone transplantation combined with PRF

ZHOU Long，F(xiàn)ENG Xing-hua，LU Bin

（Department of Oral and Maxillofacial Surgery，School of Stomatology，The Forth Military Medical University， Xi'an 710032，Shaanxi，China）

Abstract： Objective We grafted the platelet-rich fibrin（PRF） mixed with autogenous iliac bone in the alveolar cleft and evaluated the bone resorption after operation. Methods 8 dogs（8～12 months） were created bilateral alveolar cleft by surgical operation. autogenous iliac bone（control group） and the PRF mixed with autogenous iliac bone（PRF group） were implanted into the defect of one side randomly and bone regeneration was investigated 2 months and 4 months after implantation. Results The bone resorption of the PRF group was lower than that of the control group at 2 months and 4 months，P<0.01. Conclusion Autogenous iliac bone grafting with PRF，which significantly reduces postoperative bone resorption on dog bilateral alveolar cleft model.

Key words：platelet-rich fibrin（PRF）；alveolar bone grafting；three-dimensional reconstruction；bone resorption

牙槽嵴裂二期植骨手術(shù)對于大多數(shù)牙槽嵴裂的患者，是一種有效的治療方法[1]，也是唇腭裂序列治療的重要組成部分[2]。臨床上常用的辦法是取自體松質(zhì)髂骨，制備成骨塊，游離移植到牙槽嵴裂骨缺失的部位。這一手術(shù)很大程度上解決了牙槽嵴裂患者牙槽嵴形態(tài)不完整、恒牙無法正常萌出、唇鼻外形塌陷畸形等諸多問題，也能為之后的牙列修復(fù)治療提供必要的條件。然而，臨床醫(yī)生們發(fā)現(xiàn)植入的骨組織并不能完全成活，或多或少的伴有骨吸收的發(fā)生。為此，學(xué)者們不斷探索加速骨生長，減少骨吸收的辦法。Eriko Marukawa等[3]將富血小板血漿 （platelet-rich plasma，PRP）與自體髂骨復(fù)合移植修復(fù)牙槽突裂，發(fā)現(xiàn)這一方法能夠減少植骨術(shù)后的骨吸收。富血小板血漿（PRP）含有大量血小板并且能夠釋放PDGF、TGF-β以及VEGF等多種生長因子促進骨形成。2006年由法國學(xué)者Choukroun等[4-6]報道了一種新的血小板富集方法：富血小板纖維蛋白（Platelet-rich fibrin，PRF），這種方法與富血小板血漿（PRP）的制備相比，不需要抗凝劑也不需要凝血酶，使得它的應(yīng)用更加安全和簡便。學(xué)者們將富血小板纖維蛋白（PRF）應(yīng)用于牙周、種植等領(lǐng)域的疾病治療中，發(fā)現(xiàn)PRF有很好的促進骨形成的特性[7-9]。本實驗旨在研究將PRF引入牙槽嵴裂植骨手術(shù)是否能促進術(shù)后的骨生長、減少骨吸收。

1 材料和方法

1.1實驗動物及動物模型：本實驗參照楊雁等[10]犬的單側(cè)牙槽嵴裂即刻植骨模型的方法，設(shè)計雙側(cè)牙槽嵴裂植骨模型。選用犬8只，性別不限，年齡8～12月齡，體重10～15Kg，所有試驗犬均體健，牙列完整，咀嚼功能正常。實驗采用同體對照的方法，隨機設(shè)置同一只動物的左側(cè)或右側(cè)為實驗組，另一側(cè)為對照組。實驗組：植入PRF與自體髂骨的混合物；對照組：僅植入自體髂骨。由于楊雁等[12]已驗證這種模型制備方法，故未設(shè)置空白對照。

1.2手術(shù)步驟

1.2.1 PRF的制備：術(shù)前髂部及頸部備皮，禁食水6h，稱重，肌肉注射速眠新0.1ml/Kg及3%戊巴比妥鈉0.5ml/Kg麻醉。仰臥位固定，充分顯露頸部，0.5%碘伏消毒頸部皮膚，常規(guī)鋪單。于甲狀軟骨水平，頸中線偏左2cm，向下行3cm長切口切開皮膚，分離出頸靜脈，一次性采血20ml，迅速分盛于2支10ml玻璃離心管內(nèi)，以3000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，之后縫合頸部切口。離心后可見試管內(nèi)分為3層：最上層是無細(xì)胞血漿層，為半透明的淡黃色液體；下層為血細(xì)胞層，含有大量的紅細(xì)胞；兩者之間的半透明淺黃色凝塊即為富血小板纖維蛋白（PRF）。

1.2.2 制備上頜雙側(cè)牙槽嵴裂：頭面部及口內(nèi)消毒，鋪單，利多卡因浸潤麻醉術(shù)區(qū)。沿上唇系帶自齦緣至前庭溝底切開至骨面，再沿雙側(cè)中切牙、雙側(cè)第一、二側(cè)切牙齦緣至雙側(cè)尖牙近中側(cè)切開粘膜至骨面，形成倒T形切口，翻起頰側(cè)粘膜至鼻底部，顯露骨組織。腭側(cè)沿齦緣切開中切牙遠(yuǎn)中至尖牙近中粘膜至骨面，翻起粘膜瓣與頰側(cè)暴露位置相對應(yīng)。以骨鉆磨切，生理鹽水沖淋降溫，先于尖牙近中處，沿牙體長軸方向制備一個裂隙，上至鼻底，深達鼻腭孔，方向與顱骨長軸方向垂直。再于第一側(cè)切牙近中沿牙體長軸方向制備一個裂隙，深至腭側(cè)骨壁，制備時偏遠(yuǎn)中，減少對中切牙牙根的損傷。之后在腭側(cè)制備一裂隙將前兩個裂隙連通，方向平行于顱骨長軸。最后在確認(rèn)鼻底粘膜完整的情況下，以咬骨鉗連同骨段及第一、二側(cè)切牙一同截下，得到近似矩形的骨缺損。另一側(cè)以同樣方法制備，即得到了雙側(cè)牙槽嵴裂骨缺損的模型。

1.2.3 取髂骨術(shù)：解開一側(cè)固定的后肢，犬使下半身改為側(cè)臥位。沿髂前上嵴外側(cè)緣行長約4cm的切口切開皮膚，解剖暴露出髂前上嵴，以骨鉆將髂前上嵴處骨質(zhì)整塊截下，大小約2cm×3cm，呈矩形。充分止血后，關(guān)閉切口。將取下的髂骨制備成直徑2～3mm大小的碎骨塊，等分成兩份，待用。

1.2.4 牙槽嵴裂植骨：取出離心完成的玻璃離心管，將管口消毒，以止血鉗將富血小板纖維蛋白層（PRF）連同下方的血細(xì)胞層一起夾出，剪去下方的血細(xì)胞層分離，把PRF至于無菌干紗布上，以另一塊紗布將其壓成薄片，即得到PRF膜片，再將PRF膜片剪碎，制備成直徑約1mm的PRF碎塊，隨機加入一份碎骨塊，充分混合。將兩份骨塊按照實驗計劃分別填于兩側(cè)骨缺損，適當(dāng)加壓，充分填勻，保證粘膜瓣無張力的情況下嚴(yán)密縫合，關(guān)閉切口。

1.3 術(shù)后處理：術(shù)后實驗動物進半流質(zhì)飲食，術(shù)后連續(xù)3日肌注青霉素預(yù)防感染，每日觀察口內(nèi)切口并行頸部及髂部切口換藥，10日后拆除頸部髂部縫線。分別于術(shù)后當(dāng)日、2個月、4個月時拍攝上頜骨CT。楊雁等[10]在術(shù)后8周時發(fā)現(xiàn)宿主骨與移植骨完全融合，12周時骨吸收趨于穩(wěn)定，考慮到實驗動物的個體差異，故將CT拍攝時間定為術(shù)后2個月與4個月。

1.4 影像學(xué)評價與測量：在以往的研究中，對于植骨效果的評估是采用拍攝二維平片的方法。二維平片存在的問題是投照角度無法固定導(dǎo)致圖像放大畸變，另外二維影像學(xué)資料只能測量牙槽嵴高度這一單一指標(biāo)，無法測量體積變化。隨著CT及三維重建軟件的發(fā)展，三維測量實現(xiàn)了可能。

1.4.1三維重建原理：三維重建的原理就是將連續(xù)的多張平面圖像疊加起來，還原成三維圖像。在臨床病例中，由于牙槽嵴裂患者的骨缺損形狀不規(guī)則，重建及測量體積十分復(fù)雜。所以在制造缺損時就要考慮測量的問題，本實驗中截骨方向均垂直或平行于顱骨的長軸方向，水平位上看，植骨區(qū)的形狀近似于一個梯形，冠狀位上，每一層圖像上的植骨部位近似一個矩形。拍攝CT行冠狀位掃描，再以冠狀位的平面圖像進行三維重建。

1.4.2 體積測量方法：本實驗使用的是mimics10.01軟件。術(shù)后當(dāng)日，實驗犬全麻拍攝第1次CT，此時的可以確定植入骨質(zhì)的總量，術(shù)后2個月、4個月的CT反應(yīng)這兩個時間點骨生長情況。首先分別將這3個時間點的影像重建，利用mimics將其擬合，即重疊在一起，這時可以看到同一部位不同時間點的圖像。在CT圖像上，我們可以很輕易地區(qū)分完整骨段與碎骨塊，這樣就可以利用術(shù)后當(dāng)日的圖像定位出植骨的范圍，利用軟件選中每層圖像上包含植骨區(qū)的區(qū)域，將它們疊加起來，即可以算出植骨區(qū)域的體積，比較不同時間點的植骨區(qū)體積，即可以算出植入骨質(zhì)的吸收情況。分別計算出每個時間點每只犬實驗側(cè)與對照側(cè)的骨吸收率，進行配對t檢驗，檢驗是否有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物情況：所有實驗動物均正常成活，術(shù)后未出現(xiàn)傷口感染，骨塊排出等情況。

2.2 CT影像：術(shù)后當(dāng)日CT顯示，雙側(cè)骨缺損均完整充填，可清晰地分辨出移植骨與宿主骨，由于實驗側(cè)混有PFR碎塊，實驗側(cè)骨質(zhì)密度低于對照側(cè)（如圖1c）。術(shù)后2個月CT顯示，移植骨與宿主骨已無明顯界限，兩側(cè)均有骨質(zhì)吸收的情況發(fā)生，對照側(cè)骨質(zhì)吸收的情況明顯大于實驗側(cè)，邊緣骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)已開始形成，但密度仍小于正常骨皮質(zhì)密度（圖1b）。術(shù)后4個月CT顯示，雙側(cè)植骨區(qū)骨質(zhì)吸收仍在繼續(xù)，但程度已較術(shù)后2個月時明顯減少，骨皮質(zhì)密度已與正常骨皮質(zhì)接近，對照側(cè)骨質(zhì)吸收明顯大于實驗側(cè)（圖1c）。

2.3三維重建圖像：三維重建圖像上可以直觀看出對照側(cè)的骨吸收情況大于實驗側(cè)。骨的吸收主要發(fā)生在外側(cè)緣，遠(yuǎn)離宿主骨的部位有更明顯的吸收，呈向內(nèi)凹陷的形態(tài)（如圖2）。

2.4 體積測量：2個月時，實驗側(cè)吸收率（11.37±1.51）%、對照側(cè)（21.89±3.54）%，使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行配對樣本的t檢驗，P<0.01。4個月時，實驗側(cè)吸收率（16.16±2.03）%、對照側(cè)（25.60±3.61）%，進行配對樣本的t檢驗，P<0.01（如圖3）。

3 討論

3.1 PRF與骨生長：實驗中筆者發(fā)現(xiàn)PRF的加入可以促進骨形成，在一定程度上減少骨吸收。PRF有一個重要的特性：可以持續(xù)的釋放生長因子。Dohan ED等[11]的實驗發(fā)現(xiàn)，PRF膜片在至少1周的時間內(nèi)緩慢釋放TGF-β1、VEGF、PDGF等生長因子，隨著PRF膜片的分解，包含在其中的細(xì)胞因子被逐步釋放出來造成了PRF的緩釋作用。這些生長因子的緩慢釋放可以在術(shù)后的一段時間內(nèi)有效的促進成骨細(xì)胞的增殖，生長更多的新骨，還可以促進血管的生成，使新骨更早的建立血供。孫潔等[12]通過對PRF的HE染色組織切片及掃描電鏡和透射電鏡的觀察，證實了PRF的主要結(jié)構(gòu)是纖維蛋白形成的疏松的三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)這種纖維蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)與人類天然的組織結(jié)構(gòu)非常相似，這種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和細(xì)胞增殖，并有利于營養(yǎng)物質(zhì)的彌散進入。在牙槽嵴裂植骨手術(shù)中，使用的是自體髂骨，其中包含有大量的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。魏思維等[13]研究發(fā)現(xiàn)，富血小板纖維蛋白可以誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，且分化的類成骨細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的特性。在本實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，兩側(cè)植骨區(qū)的骨吸收都發(fā)生在遠(yuǎn)離骨壁的部位，尤其是對照側(cè)出現(xiàn)了明顯的向內(nèi)凹陷的形狀。筆者推測，這種現(xiàn)象與血供的建立有關(guān)，與骨壁接近的部位可以更早的建立血供，植骨區(qū)遠(yuǎn)端的骨塊難以在早期建立有效的血供，所以更容易吸收。與對照側(cè)相比，實驗側(cè)并未出現(xiàn)明顯的向內(nèi)凹陷的骨吸收形態(tài)，邊緣呈不整齊的形態(tài)，隱約可見植入骨塊的形態(tài)?？梢酝茰y，實驗側(cè)的血供建立早于對照側(cè)，使得位于遠(yuǎn)端的骨塊更容易成活。實驗側(cè)的骨塊中混有PRF膜片，在膜片的分解過程中，包含在其中的生長因子被逐步釋放出來，使得血管的形成能夠更早發(fā)生，遠(yuǎn)端的骨塊成活的更多，而對照側(cè)的血供仍只能以正常的速度建立，于是便出現(xiàn)了實驗側(cè)與對照側(cè)骨吸收差異。

3.2PRF與PRP：富血小板血漿（PRP）對于牙槽嵴裂植骨的作用已經(jīng)被學(xué)者們所證實，然而其在制備使用的過程中仍然存在一些問題。它的制備過程仍沒有一套統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，并且在應(yīng)用時需要加入外源性凝血酶，這就使得其在應(yīng)用時需要考慮安全性的問題，與PRP相比，富血小板纖維蛋白（PRF）在制備時過程中不需要加入凝血酶及抗凝劑，制備過程更加簡單，制備所需材料僅為自體血，其安全性得到了保證[4-6]。正是因為具備了這樣的特性，使得PRF更加具有臨床應(yīng)用的價值。

3.3 對臨床的啟示：本實驗采用的是犬的即刻植骨模型，與臨床患者的情況仍有一定差異，牙槽嵴裂的患者的植骨區(qū)骨壁為皮質(zhì)骨，而實驗動物的植骨區(qū)骨壁為新鮮的骨創(chuàng)面，血供充足。從實驗結(jié)果來看，即使是對照側(cè)的骨吸收率，也低于一些文獻報道中的臨床病人牙槽嵴植骨手術(shù)的骨吸收率，這提示我們，在臨床手術(shù)時，刻意的制造植骨區(qū)骨壁的骨創(chuàng)面是否能夠提高手術(shù)效果，值得我們進一步研究。

3.4 三維影像測量：自牙槽嵴裂手術(shù)開始之時，人們便在探索手術(shù)效果的評價方法，最早只能拍攝二維的平片，于是出現(xiàn)了基于牙槽嵴高度、裂隙容納骨量、植骨位置及骨量等多種測量方法，但這些方法均不能避免圖像畸變、解剖結(jié)構(gòu)重疊、不便于量化比較等缺點[14]。隨著CT技術(shù)及計算機軟件的發(fā)展，出現(xiàn)了三維影像重建技術(shù)，這一技術(shù)可以實現(xiàn)對組織結(jié)構(gòu)的精確、直觀的觀察，更重要的是，這一技術(shù)可以實現(xiàn)對體積的測量。對于牙槽嵴裂植骨骨吸收的研究，體積的變化是十分可靠的評價標(biāo)準(zhǔn)。在本實驗中，筆者為了便于體積測量，將骨缺損設(shè)計成了較為規(guī)則的形狀，缺損各骨壁均與犬顱骨長軸平行或垂直，通過測量各個時間點的體積，計算出骨吸收的情況，這種方法可以作為一種研究牙槽嵴裂骨吸收率的實驗方法。但由于牙槽嵴裂患者缺隙的形態(tài)十分復(fù)雜，在臨床上尚無一種公認(rèn)的測量方法及標(biāo)準(zhǔn)，仍需學(xué)者們繼續(xù)探索。

本實驗證明，將PRF加入自體髂骨進行骨移植修復(fù)犬的牙槽嵴裂，在術(shù)后4個月的時間范圍內(nèi)，可以減少術(shù)后的骨吸收。但仍有一些問題尚不清楚，如PRF作用用于植骨手術(shù)的具體機制、PRF與骨塊的比例等。這些問題仍需我們近一步研究。

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