SGLT2抑制劑達格列凈對糖尿病腎病的保護機制研究

曹雨琛，李成強，劉鑒穎，宋 葳，孫昕昳

(北華大學附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病的主要慢性并發(fā)癥之一，是終末期腎衰竭的主要原因，目前尚無有效的治療方法.鈉-葡萄糖共轉運蛋白2(Sodium-glucose cotransporter 2，SGLT2)是鈉-葡萄糖共轉運蛋白家族中的一種[1]，主要分布腎臟近曲小管，介導葡萄糖的重吸收.SGLT2抑制劑代表藥物達格列凈是一種新型降糖藥，它的作用機制是通過抑制腎臟近曲小管對葡萄糖的重吸收，使過量的葡萄糖從尿中排出，導致血糖降低.目前有研究[2]表明：SGLT2i達格列凈不僅可以降低血糖，還對DN有保護作用，但具體機制尚未明確.DN的發(fā)病機制比較復雜，目前公認與腎臟血流動力學改變、氧化應激、糖代謝異常、遺傳易感性及細胞凋亡等關系密切[3-6]，SGLT2i達格列凈在DN中與細胞凋亡關系尚未闡明.內(nèi)質網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress response ERS)途徑是細胞凋亡途徑之一，Caspase12蛋白是ERS特有的凋亡蛋白，因此，本研究通過SGLT2i達格列凈作用于db/db小鼠DN模型，觀察SGLT2i達格列凈對DN的影響，并進一步探討其保護機制.

1 材料與方法

1.1 動 物

選用雄性db/db小鼠(平均6周齡，體質量(55±10)g；n=21)和雄性wt小鼠(平均6周齡，體質量(26±1)g；n=20)，均由南京生物醫(yī)藥研究院實驗中心提供.所有小鼠飼養(yǎng)在室溫(20±1) ℃、12 h光照/12 h暗周期下，投喂普通飼料(中國北京奧謝利飼料有限公司)和干凈水.在實驗開始前，先適應性喂養(yǎng)2周，觀察小鼠自然情況，小鼠適應后開始制模喂養(yǎng)4周，期間測量小鼠的體質量、血糖，留取24 h蛋白尿、UACR、血肌酐，并于4周末隨機抽取1只db/db小鼠做腎臟病理，確定小鼠DN改變.DN模型制作成功后，將wt組小鼠隨機分為wt組、wt+SGLT2i組，將DN模型的db/db小鼠隨機分為db/db組、db/db+SGLT2i組，共4組，每組10只.其中wt+SGLT2i組、db/db+SGLT2i組小鼠用生理鹽水溶解達格列凈(10 mg/片)，按1 mg/(kg·d-1)灌胃，wt組和db/db組小鼠按100 μL/10 g生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)12周，期間測量小鼠體質量、血糖、UACR、24 h尿蛋白、血肌酐，并在第12周末取材.

所有動物程序均經(jīng)北華大學機構動物保護和使用委員會批準，小鼠嚴格按照《醫(yī)學實驗動物保護和使用指南 》(中華人民共和國衛(wèi)生部，2011年)和《北華大學實驗動物倫理標準指南》進行處理.

1.2 方 法

取材時，用冰生理鹽水沖洗腎臟，然后稱重.通過比較腎臟濕質量和體質量來評估腎臟肥大指數(shù).應用尿液分析試紙條(干化學法)檢測UACR，應用ELISA 法檢測24 h蛋白尿和血肌酐.

病理檢查：收集各組小鼠腎組織，用40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，3～4 μm厚切片，蘇木素伊紅染色.

透射電子顯微鏡：腎皮質用2%戊二醛固定在4 ℃的碳酸氫鹽緩沖液中，后固定在1%四氧化二釤中，用2%醋酸鈾酰染色，將樣品脫水并包埋在Poly/Bed 812 Araldite樹脂中.超薄切片(50～100 nm)用超微切割機切割，安裝在銅網(wǎng)上，用Tecnai10透射電子顯微鏡(飛利浦公司，荷蘭)檢查.使用Megaview G2 CCD相機(明斯特軟成像系統(tǒng)有限公司，德國)在6 200倍的放大率下拍攝數(shù)字圖像.

免疫組織化學染色：腎組織用40 g/L多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，3～4 μm厚切片，脫蠟后用3%過氧化氫甲醇溶液室溫封閉內(nèi)源性過氧化物酶30 min.應用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)與2%牛血清白蛋白預孵育30 min以阻斷非特異性反應，與兔抗人Caspase12多克隆抗體以1∶400倍稀釋，4 ℃孵育過夜(香港Abcam公司).切片用PBS洗滌，結合抗體用SP1試劑盒(北京中山金橋生物科技有限公司)檢測，在0.05% 3，3-二氨基聯(lián)苯胺和0.03% H2O2中可見免疫反應產(chǎn)物.切片后用蘇木精反染、脫水、清除、計數(shù)，在奧林巴斯BX51顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)下觀察.在對照染色中，切片與山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)孵育(香港Abcam公司).

Western blot分析：腎組織勻漿于RIPA緩沖液50 mmol Tris-HCl(pH 7.5，含有150 mmol NaCl、1 mmol Na2EDTA、1 mmol EDTA、1%Triton、2.5 mmol焦磷酸鈉、1 mmol β-甘油磷酸鈉、1 mmol Na3VO4、1 mmol NaF、1 μg/mL亮肽素和1 mmol PMSF(南京Beyotime生物技術研究所))中提取總蛋白.將均質樣品煮沸5 min，在-20 ℃保存，應用皮爾斯生物化學試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)測定蛋白質濃度.蛋白質印跡分析中蛋白裂解產(chǎn)物(30～50 μg)用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Beyotime Institute Of Biotechnology)溶解，然后轉移到P膜上(馬薩諸塞州波士頓米利波爾公司，美國).用5%脫脂奶粉在緩沖液(10 mmol Tris-HCl(pH 7.6，含有100 mmol NaCl、0.1%Tween 20)中室溫封閉2 h，然后分別與一抗兔抗Caspase12(Abam公司，美國)、鼠抗β-肌動蛋白的單克隆抗體(Abam公司，美國)1∶1 000稀釋，4 ℃過夜，與辣根過氧化物酶標記的二抗(杭州華安生物科技有限公司)在1∶2 000倍稀釋下室溫孵育1.5 h.免疫反應條帶用3，3-二氨基聯(lián)苯胺(Sigma-Aldrich公司，德國)顯影.應用Tanon GIS凝膠成像儀(中國Tanon科技股份有限公司)測量并分析具有代表性的波段.蛋白質水平歸一化為β-肌動蛋白，比值表示為3個獨立實驗的均數(shù)±標準差.使用Quantity One 1-D軟件通過密度計量法對蛋白質水平進行量化.應用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)根據(jù)檢測試劑盒(羅氏公司，美國)說明書進行細胞凋亡檢測.具體方法：將切片充分脫蠟和水化，脫蠟20 min(60 ℃)，再用二甲苯浸洗2次(5 min)，用梯度酒精從高濃度到低濃度浸洗，達到水化；再浸入4%多聚甲醛15 min，PBS浸洗2次；然后應用蛋白酶K孵育20 min，延長1 h TUNEL反應液的時間；PBS清洗5次，DAB顯色10 min.隨機選擇6個實驗組，計數(shù)具有特征性核碎裂(綠色染色)的凋亡細胞.實驗重復3次.

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 SGLT2i對db/db小鼠腎損傷的影響

實驗結果顯示：與wt組比較，db/db小鼠DN組血糖、腎質量/體質量比、血肌酐、24 h尿蛋白及UACR均明顯升高，而體質量明顯降低(P<0.05).與db/db組比較，db/db+SGLT2i組UACR、24 h尿蛋白、血肌酐及血糖水平明顯降低(P<0.05)，體質量也有所減輕，但腎質量/體質量比值無明顯變化(見圖1 a～f).組織病理學結果顯示：與wt組比較，db/db組腎小球鮑曼間隙縮小，腎小球基底膜增厚，系膜基質擴張，系膜細胞增生(P<0.05).與db/db組比較，db/db+SGLT2i組上述病理改變均減輕(P<0.05，見圖1 g).透射電鏡觀察腎臟的超微結構結果顯示：與wt組比較，db/db組腎小球基底膜增厚，膜濾過層結構不清，足細胞足突紊亂，間隙增寬，系膜基質增多(P<0.05).與db/db組比較，db/db+SGLT2i組的上述情況明顯減輕(P<0.05，見圖1 h)，表明SGLT2i達格列凈可以減輕db/db小鼠的腎臟損傷.

*.wt與db/db組比較P<0.05；db/db組與db/db+SGLT2i組比較P<0.05.a～f wt組、wt+SGLT2i組、db/db組和db/db+SGLT2i組小鼠的體質量、血糖、腎質量/體質量、24 h尿白蛋白、肌酐及UACR的數(shù)值；g 蘇木精-伊紅染色；h 組織病理學.圖1 SGLT2i達格列凈對糖尿病腎病小鼠腎臟損傷的影響Fig.1 Effect of SGLT2i Dapagliflizin on renal injury in db/db mice with diabetic nephropathy(×400)

2.2 SGLT2i達格列凈對db/db DN小鼠模型的細胞凋亡及ERS途徑相關蛋白Caspase12蛋白表達的影響

實驗結果顯示：和wt組比較，db/db DN組小鼠腎小管上皮細胞凋亡明顯升高；和db/db組比較，db/db+SGLT2i組細胞凋亡明顯降低(見圖2 a).此外，分別利用免疫組化和Westernblot法檢測內(nèi)質網(wǎng)應激相關蛋白Caspase12蛋白，結果顯示：與wt組比較，db/db組小鼠的Caspase12蛋白表達明顯升高；與db/db組比較，db/db+SGLT2i組Caspase12蛋白表達明顯降低(圖2 b～c).

*.P<0.05.a TUNEL染色及細胞凋亡情況；b 免疫組化法觀察各組Caspase12蛋白的表達(×200)；c Western blot法觀察各組Caspase12蛋白的表達圖2 SGLT2i達格列凈對DN小鼠腎小管的細胞凋亡及減輕內(nèi)質網(wǎng)應激相關Caspase12蛋白表達的影響Fig.2 Effect of SGLT2i Dapagliflizin on renal tubular apoptosis and expression of endoplasmic reticulum stress-related Caspase12 protein in db/db mice with diabetic nephropathy

3 討 論

隨著社會的發(fā)展及人口老齡化、生活方式等改變，糖尿病(Diabetes mellitus，DM)患病率急劇上升.根據(jù)流行病調查，我國2型糖尿病發(fā)病率高達到11.6%[4]，DM所產(chǎn)生的并發(fā)癥也隨之增加，因此，DM已成為全世界共同面臨的健康問題.

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)是DM最主要的并發(fā)癥之一，也是終末期腎病(End stage renal disease，ESRD)的主要病因，隨著DM發(fā)病率的增高，DN發(fā)病率也比過去10 a增加了兩倍以上，占所有ESRD的50%[5].DN導致患者生活質量下降，所以，防治DN成為治療DM的關鍵之一.但是DN發(fā)病機制復雜，目前認為與腎臟血流動力學改變、糖代謝異常、氧化應激、異常免疫、遺傳因素等相關[3，6].隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)DN也與細胞凋亡關系密切[7].細胞凋亡途徑之一是內(nèi)質網(wǎng)應激途徑(Endoplasmic reticulum stress response，ERS)，Caspase12蛋白是ERS特有的凋亡蛋白.本研究結果顯示：與db/db DN組比較，db/db組Caspase12蛋白表達明顯增高，提示DN時，Caspase12蛋白能夠激活ERS凋亡途徑.其他研究[8-9]表明，DN時Caspase12蛋白表達上調，對DN有損害作用；LIU等[10]研究也提示，Caspase12蛋白表達下調對DN有保護作用.SGLT2是鈉-葡萄糖轉運載體家族(Sodium-dependent glucose transports SGLTs)中的一種單體，它可以高選擇性作用于腎臟近曲小管，促進葡萄糖的重吸收.SGLT2抑制劑(SGLT2i)代表藥達格列凈(Dapagliflozin)是一種新型降糖藥，它通過抑制腎臟近曲小管對葡萄糖的重吸收，使過量的葡萄糖從尿液中排出，從而降低血糖.隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)SGLT2抑制劑不僅有降低血糖作用，還有降低血壓、降低心血管終點事件、減重、保護胰島β細胞功能等作用，也對DN有一定的保護作用[11].但SGLT2i達格列凈對DN保護作用的具體機制尚不明確.本研究結果證實：SGLT2i達格列凈可以減少db/db小鼠的24 h蛋白尿及UACR(見圖1 d)，腎臟病理提示SGLT2i達格列凈可以減輕縮小的腎小球鮑曼間隙、增厚的腎小球基底膜、擴張的系膜基質以及增生的系膜細胞(見圖1 g).電鏡結果顯示：SGLT2i達格列凈可以減輕足細胞足突的紊亂(見圖1 f)，提示SGLT2i達格列凈對腎臟有保護作用.SHIN SJ等[12]的研究也顯示：SGLT2i達格列凈對DN有保護作用，其作用機制是通過減輕腎臟氧化應激、減輕炎癥反應實現(xiàn)的.有研究[13]應用SGLT2i恩格列凈治療db/db鼠，發(fā)現(xiàn)腎小球損傷也得到改善，其機制與減輕炎癥和纖維化有關.SGLT2i魯格列凈治療糖尿病小鼠后可以延緩DN晚期eGFR的進行性下降，從而減少腎小球屏障損傷和腎纖維化程度[14].SGLT2i伊格列凈和依帕列凈通過改善糖尿病脂質代謝紊亂、減少全身氧化應激和炎癥，從而減少腎臟損傷[15-16].細胞凋亡是DN的發(fā)病機制之一[17]，我們的前期研究[18]結果也發(fā)現(xiàn)：DN時，細胞凋亡增加，并且細胞凋亡途徑之一的ERS相關蛋白Caspase12表達上調，下調Caspase12蛋白的表達對DN有保護作用[19]，LIU Tingting等[20]也有同樣的研究結果.本研究發(fā)現(xiàn)：SGLT2i達格列凈可以減少腎小管上皮細胞的細胞凋亡(見圖2 a)，并且使ERS相關蛋白Caspase12的表達下調(見圖2 b～c)，因此，我們認為SGLT-2i達格列凈對DN有保護作用其可能的機制與改善ERS細胞凋亡途徑有關.由于ERS途徑有3條主要信號轉導途徑，具體與哪條信號轉導途徑有關目前還不明確，今后將在我們的實驗研究中進一步闡明.

綜上所述，本實驗從細胞凋亡角度證實了SGLT2i達格列凈對DN的影響，這為SGLT2i達格列凈對DN具有保護作用提供了實驗室依據(jù).