雜種黃秋葵莖尖及試管苗培養(yǎng)的研究

摘 要：采用莖尖和試管苗培養(yǎng)的方法，以黃秋葵生長點為材料，進行了生長點的生長、分化芽的生根和試管苗的生根繼代增殖培養(yǎng)，以及試管苗的移栽與定植的研究。結(jié)果表明：1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1是生長點伸長生長的理想培養(yǎng)基；MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO30.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1是生長芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基；1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1是分化芽生根培養(yǎng)和生根繼代增殖培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。試管苗移栽成活率為94.7%；定植成活率為97.4%；定植的試管苗保持了雜種黃秋葵的雜種優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：黃秋葵；組織培養(yǎng)；試管苗

中圖分類號：Ｓ６４１ 文獻標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.02.00４

Study on Propagation for Tender Buds and Tube Seedlings of Abelmoschus esculentus

XIA Hong-fei， LIU Lin-lin， LI Hui， WANG Xiao-xu， JIANG Chang-yang

（College of Life Sciences， Liaoning Normal University， Dalian， Liaoning 116029， China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Using the culture methods of shoot tip and tube seedlings， the Abelmoschus esculentus growing point for the material， the study was mainly on growth of growing points， differentiation of differentiation bud， rooting and subculturing of tube seedlings， and tube seedlings transplanting colonization. The results demonstrated that： 1/2MS + ZT 0.2 mg·L-1 + NAA 0.3 mg·L-1 was the optimum medium for the elongation growth of growing points； MS+6-BA 0.7 mg·L-1 + AgNO30. 8 mg·L-1 + NAA0.1 mg·L-1 was the suitable medium for differentiation cultivation of growth bud； 1/3MS + ABT 0.6 mg·L-1 + sucrose 10 g·L-1 + IAA 0.4 mg·L-1 was the optimum medium for differentiation， rooting and subculture of differentiation bud. The transplanting survival rate of tube seedlings was 94.7% and stable planting survival rate was 97.4%. Colonization of plantlets maintained the heterosis of Abelmoschus esculentus.

Key words： Abelmoschus esculentus； ｔissue culture； ｔube seedlings

黃秋葵（Abelmoschus esculentus）又稱秋葵、補腎菜、阿華田、羊角豆等，屬于錦葵科秋葵屬一年生草本植物[1-2]。黃秋葵全株含黃酮和多種微量元素等有效成分，具有抗疲勞、提高免疫力和抗癌等功效，能治皮膚癌、燒傷、燙傷、胃炎和胃潰瘍等疾病[3-4]。近年來果實的食用研究發(fā)現(xiàn)，黃秋葵的嫩果作為蔬菜食用，具有非常明顯的補腎壯陽作用，由此引起人們的高度重視。

黃秋葵是異花授粉植物，偶爾會在實生苗植株中出現(xiàn)1株生長旺盛、結(jié)果多、具有明顯雜種優(yōu)勢（以下簡稱雜種黃秋葵）的植株。但是，由于黃秋葵只能通過種子進行繁殖，因此無法使雜種黃秋葵的種質(zhì)得到保存。為滿足人們栽培的需要，使雜種黃秋葵的種質(zhì)得到保存，2010年7月，再次發(fā)現(xiàn)雜種黃秋葵植株時，對其進行了生長點和試管苗培養(yǎng)的研究。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 材料培養(yǎng)及滅菌 7月中旬，將在大連郊區(qū)發(fā)現(xiàn)的雜種黃秋葵的植株頂端剪掉，采用頂端優(yōu)勢的措施，促進分枝，增加生長點的數(shù)量。待8月上旬生長出6個分支，并形成多個生長點后，將分枝采回實驗室，除掉葉片后，將具有生長點的嫩莖放到廣口瓶中，用無菌水洗滌3次后，再用0.01%的安利洗滌液洗滌5 min左右，接著用蒸餾水漂洗2次。轉(zhuǎn)移到超凈工作臺上，用70%的乙醇滅菌10 s左右，立刻用無菌水洗滌3次，再用0.05%的HgCl3溶液振蕩滅菌10 min，接著用無菌水振蕩洗滌6次，即可獲得具有生長點的嫩莖。

1.1.2 培養(yǎng)條件 以附加不同濃度、不同種類的細胞分裂素、生長素的MS或1/3MS為培養(yǎng)基。以MS為基本培養(yǎng)基附加蔗糖30 g·L-1，以1/3MS為基本培養(yǎng)基附加蔗糖10 g·L-1。培養(yǎng)基的pH值為6.0。培養(yǎng)過程在暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)兩種條件下進行。光培養(yǎng)的光照度3 000 lx，12 h·d－１，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 生長點的伸長生長培養(yǎng) 在超凈工作臺上，將無菌嫩莖切成邊長0.5 cm左右、具有1個生長點的莖段（下稱莖段），接種到附加不同濃度的IBA、NAA或IAA的1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1的培養(yǎng)基上，進行生長點伸長生長培養(yǎng)試驗。試驗重復(fù)2次，每個培養(yǎng)基接種10個具有生長點的莖段。

1.2.2 生長芽分化培養(yǎng) 把由生長點培養(yǎng)的生長芽剪成長約0.8 cm、具有2個生長點的莖段后，接種到以MS+6-BA 0.7 mg·L-1為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度AgNO3與不同濃度NAA組合使用的培養(yǎng)基上，進行對生長芽分化培養(yǎng)的影響試驗。分化培養(yǎng)的前20 d進行暗培養(yǎng)，之后進行光照培養(yǎng)。生長芽的分化培養(yǎng)試驗每種培養(yǎng)基接種50個莖段，重復(fù)2次。

1.2.3 分化芽生根培養(yǎng) 將以上培養(yǎng)的分化芽從基部剪下，接種到1/3MS+ABT 2號（以下簡稱ABT）0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1為基本培養(yǎng)基，附加濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg·L-1的 IAA、IBA、NAA的培養(yǎng)基上，進行不同濃度生長素對分化芽生根的影響試驗。不同濃度生長素對分化芽生根的影響試驗重復(fù)2次，每種處理接種100個材料。

1.2.4 試管苗生根繼代增殖培養(yǎng) 把生根試管苗剪成長約1.5 cm、至少有2個生長點的莖段后，接種到1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L－１+IAA 0.4 mg·L-1培養(yǎng)基上，進行試管苗的生根繼代增殖培養(yǎng)試驗。試驗重復(fù)3次，每次繼代增殖培養(yǎng)6代，每代接種培養(yǎng)400個莖段。

1.2.5 試管苗的移栽、定植 將生根繼代增殖培養(yǎng)試管苗洗去根部的培養(yǎng)基，放到底部有一層約1 cm深干凈水層的塑料盤中，在光照下煉苗3 d后，將其移栽到上層為6～10 cm厚干凈河沙的溫室苗床上或花盆中。移栽后要保持前12 d遮光、溫度≥18 ℃、濕度約85%的環(huán)境條件。試驗重復(fù)2次，移栽株數(shù)分別為200株。其中每次盆栽10株，苗床栽190株。并在每個花盆中同時定植上3株沒有雜種優(yōu)勢的實生苗進行對照。

當(dāng)苗床上移栽成活的試管苗長出約3片新葉時，定植到大連郊區(qū)農(nóng)田上，并同時定植實生苗。在花盆中移栽成活的試管苗有的搬到實驗室中。田間定植試驗重復(fù)2次，每次定植175株，定植實生苗20株。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度生長素對生長點伸長生長培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)到40 d時觀察統(tǒng)計，結(jié)果見表1。在附加不同濃度IBA培養(yǎng)基上，生長點不能伸長生長；在附加不同濃度NAA和IAA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)的生長點均能伸長生長；但在附加不同濃度IAA培養(yǎng)基上的伸長生長效果不及在附加不同濃度NAA的效果。在附加不同濃度NAA的培養(yǎng)基上生長點的伸長生長效果也有明顯差異。其中在附加濃度為0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基上，生長點的伸長生長效果最理想，不僅生長率最高，生長芽長度最長，而且生長芽外觀長勢最好。對培養(yǎng)過程的觀察顯示，在附加濃度為0.3 mg·L-1的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)6 d可見有的生長點開始生長；培養(yǎng)到40 d時，絕大多數(shù)生長點都能培養(yǎng)成為外觀上生長旺盛的生長芽。以上結(jié)果顯示，1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1這種培養(yǎng)基是雜種黃秋葵生長點伸長生長培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.2 不同濃度的AgNO3與NAA組合使用對生長芽分化培養(yǎng)的影響

觀察顯示，在暗培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)到10 d左右時，在有的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的生長芽上接觸到培養(yǎng)基的生長點開始分化。隨后，伴隨著分化率的不斷增加，先生長的芽基部又會分化出多個分化芽。培養(yǎng)到56 d時統(tǒng)計，結(jié)果見表2。在AgNO3 0.8 mg·L-1與濃度為NAA 0.1 mg·L-1組合使用的培養(yǎng)基上，生長芽分化的效果最理想，不僅分化率最高、平均分化的不定芽數(shù)最多，并且分化的分化芽長勢旺盛。對分化培養(yǎng)過程的觀察還表明，在AgNO3 0.8 mg·L-1與濃度為NAA 0.1 mg·L-1組合使用的培養(yǎng)基上，在暗培養(yǎng)期間形成的分化芽為淡黃色，轉(zhuǎn)入到光照培養(yǎng)6 d左右，伴隨著分化芽的不斷增加，分化芽也變成了綠色。并且所有的分化芽的基部都連在一起，使培養(yǎng)的分化芽呈叢生狀。2次重復(fù)試驗的結(jié)果基本一致。以上結(jié)果證明：MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO3 0.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1 這種培養(yǎng)基是雜種黃秋葵生長芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.3 不同濃度的生長素對分化芽生根培養(yǎng)的影響

培養(yǎng)到34 d時觀察統(tǒng)計，綜合2次重復(fù)試驗結(jié)果證明，在附加濃度為0.4 mg·L-1 IAA的培養(yǎng)基上生根效果最好。在這一培養(yǎng)基上不僅平均生根率為94.3%、試管苗生根5.4條·株－１、葉片6.9個·株－１、莖粗0.23 cm、株高5.3 cm，而且外觀上試管苗長勢旺盛。結(jié)果說明，1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1這種培養(yǎng)基是雜種黃秋葵分化芽生根培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.4 試管苗生根繼代增殖培養(yǎng)

試管苗繼代增殖培養(yǎng)的結(jié)果顯示：培養(yǎng)周期為30 d，所培養(yǎng)的試管苗平均生根率為96.8%、生根6.3條·株－１、株高5.1 cm，試管苗外觀上長勢旺盛，平均每個培養(yǎng)周期的繁殖系數(shù)為2.7。按照這個速度，1株試管苗1年可繁殖2.712（約為15萬）株試管苗，除掉各種不利因素的影響，1年能保證繁殖出10萬株試管苗。這種繁殖速度可滿足對黃秋葵野生資源保護和實現(xiàn)栽培的需要。這也證明1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1這種培養(yǎng)基也是雜種黃秋葵試管苗生根繼代增殖培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。

2.5 試管苗的移栽、定植

移栽后30 d對苗床統(tǒng)計表明：第一次移栽成活177株，第二次183株，兩次共成活360株，平均成活率為94.7%。

定植后40 d時統(tǒng)計顯示：2次共成活341株，平均成活率為97.4%。觀察表明，定植的具有雜種優(yōu)勢的試管苗容易成活、生長速度快，根系發(fā)達而潔白，外觀上生長旺盛整齊。在花盆中和田間定植成活的雜種黃秋葵試管苗均在定植成活后84 d開花，113 d結(jié)出成熟的果實，并且植株生長旺盛，而在花盆中播種和田間播種的對照苗不僅幾乎不開花結(jié)果，并且長勢較弱。這說明本研究獲得的試管苗仍具有雜種優(yōu)勢。

3 結(jié)論與討論

采用莖尖和試管苗培養(yǎng)的方法，以黃秋葵生長點為材料，進行了生長點的生長、分化芽的生根和試管苗的生根繼代增殖培養(yǎng)，以及試管苗的移栽與定植的研究。結(jié)果表明： 1/2MS+ZT 0.2 mg·L-1 +NAA 0.3 mg·L-1是雜種黃秋葵生長點伸長生長培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基；MS+6-BA 0.7 mg·L-1+AgNO30.8 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1是雜種黃秋葵生長芽分化培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基；1/3MS+ABT 0.6 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+IAA 0.4 mg·L-1是雜種黃秋葵分化芽生根培養(yǎng)和生根繼代增殖培養(yǎng)的理想培養(yǎng)基。移栽后30 d平均成活率為94.7%。定植后40 d平均成活率為97.4%。

本研究通過莖尖和試管苗的培養(yǎng)，使具有雜種黃秋葵的種質(zhì)得到了保存。這不僅證明采用莖尖和試管苗培養(yǎng)的方法能使黃秋葵自然雜種的雜種優(yōu)勢種質(zhì)得到保存，而且這一技術(shù)也為其它栽培植物的非人工有利變異的種質(zhì)保存提供新途徑。

在本研究的試管苗繼代增殖培養(yǎng)研究中，每個繼代周期為30 d，而在分化芽的生根培養(yǎng)研究中的培養(yǎng)周期為34 d。同是生根培養(yǎng)，前者比后者縮短了4 d。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因：一是前者使用材料為試管苗的莖段，后者使用的材料為分化芽。莖段的長勢比分化芽旺盛，對環(huán)境的適應(yīng)性強。二是分化芽是在分化培養(yǎng)基上形成的，而試管苗的莖段是在生根培養(yǎng)基上生長的。生根繼代培養(yǎng)與生根培養(yǎng)使用的是相同的培養(yǎng)基。因此，后者在接種培養(yǎng)前，已經(jīng)對培養(yǎng)基形成了適應(yīng)性。

參考文獻：

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[4] 吳燕春，謝金群.黃秋葵的研究進展[J].中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（10）：1898-1899.