三種細(xì)菌培養(yǎng)痰標(biāo)本預(yù)處理方法學(xué)評價(jià)

[摘要] 目的 在痰標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)中，對三種痰標(biāo)本預(yù)處理方法進(jìn)行評價(jià)。 方法 收集合格痰標(biāo)本80份，同時(shí)采用三種不同的方法預(yù)處理后接種培養(yǎng)基。以直接培養(yǎng)法為對照，比較它們的陽性率差異。 結(jié)果 經(jīng)預(yù)處理后接種培養(yǎng)法陽性率均比直接培養(yǎng)法高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。3種方法間比較陽性率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 洗痰碎痰法操作簡單，成本低廉，耗時(shí)很短，處理后的痰標(biāo)本幾乎沒有雜菌干擾，建議在預(yù)處理痰標(biāo)本時(shí)推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 痰；預(yù)處理

[中圖分類號(hào)] R446.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2012）28-0101-02

由于痰液標(biāo)本留取過程中極易污染上呼吸道定植菌，為盡量減少干擾，在痰培養(yǎng)接種前要對痰標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理。本文介紹三種痰液標(biāo)本預(yù)處理的方法，并結(jié)合實(shí)際工作對這些方法的應(yīng)用進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

收集呼吸科肺部感染患者合格痰標(biāo)本80份，以直接接種為對照，同時(shí)采用以下三種方法預(yù)處理后接種平板培養(yǎng)。

1.1 生理鹽水洗滌法

將痰加入含有15～20 mL滅菌生理鹽水的試管中，劇烈振蕩5～10 s，然后用接種環(huán)將沉淀于管底的膿痰小片沾出，再放入另一試管中以同樣方法重復(fù)兩次，最后將余下的膿痰接種在培養(yǎng)基上[1]。

1.2 痰均質(zhì)化法

向痰液（洗滌后）標(biāo)本中加入等量的消化液，分解蛋白使痰液均質(zhì)化后再接種，主要有如下幾種消化液：

1.2.1 胰酶溶液 取1∶250胰酶干粉1 g加入100 mL滅菌PBS或生理鹽水中，調(diào)pH值為7.6即為1%的胰酶應(yīng)用液。使用時(shí)向痰液內(nèi)加入等量的胰酶應(yīng)用液，37℃恒溫90 min即可使痰液均質(zhì)化[1]。

1.2.2 α-糜蛋白酶溶液 工作原理同胰酶溶液相似。

1.2.3 二硫蘇糖醇溶液（SPUTASOL消化液）和N-乙酰-L-半胱氨酸溶液 兩者均是強(qiáng)還原劑，作用于粘蛋白的二硫鍵使痰液均質(zhì)化。

1.2.4 H2SO4消化法 僅適用于結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)。將痰標(biāo)本加入等量的4%H2SO4混勻，放35～37℃ 20 min（粘稠標(biāo)本在放置期間要振蕩數(shù)次）促使其液化對痰中的雜菌進(jìn)行處理。然后取出，3000 r/min，5 min離心棄去上清，加BTB指示劑1～2滴，用40 g/L NaOH中和（終點(diǎn)為淡綠色），將其接種于改良羅氏培養(yǎng)基[2]。

1.2.5 熱處理和酸處理 適用于軍團(tuán)菌分離培養(yǎng)。酸處理液（KCL-HCL）由0.2 mol/L KCL和0.2 mol/L HCL以18∶1比例混合而成，pH=2.2，二者混合后置于玻璃管中加蓋高壓滅菌待用。取200 μL經(jīng)SPUTASOL消化液處理后液化的痰液，50℃水浴30 min后再加入等量的酸處理液，放置10～15 min，離心棄上清液，加1 mL雙蒸水洗滌1次，離心棄上清液，再加200 μL雙蒸水混勻后取50 μL接種軍團(tuán)菌BCYE-DGVPC培養(yǎng)基[3]。

1.3 洗痰碎痰法

1.3.1 材料準(zhǔn)備 ①無菌痰盒；②青霉素小瓶；③紗布；④小玻璃珠；⑤無菌生理鹽水。向青霉素小瓶內(nèi)加入1～2 mL無菌生理鹽水和2～3顆小玻璃珠，加蓋并用紗布封扎瓶蓋，110℃高壓滅菌15 s取出備用。

1.3.2 操作步驟 無菌痰盒取來合格的痰標(biāo)本，加入無菌生理鹽水洗滌至少3次。洗滌時(shí)直接將無菌生理鹽水倒入痰盒中，用接種環(huán)拉住痰標(biāo)本來回拖動(dòng)，如此反復(fù)多次便能較徹底地洗去口腔中的定植菌。然后用接種環(huán)挑取已洗過三遍的痰標(biāo)本放入備用的青霉素小瓶內(nèi)，振搖1～2 min，使塊痰變成碎痰，痰內(nèi)的細(xì)菌游離于無菌生理鹽水中即可接種平板[4]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以各種預(yù)處理方法獲得病原菌標(biāo)本數(shù)占各組標(biāo)本數(shù)的百分率分別計(jì)算陽性率，各組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

見表1、2。

表1 三種方法痰標(biāo)本預(yù)處理后接種培養(yǎng)結(jié)果分別與對照組比較

3討論

表1、2顯示，痰標(biāo)本不經(jīng)預(yù)處理直接接種培養(yǎng)陽性率最低，與經(jīng)預(yù)處理后接種培養(yǎng)陽性率比較均有顯著性差異（P <0.05）。三種預(yù)處理方法中，陽性率從高到低順序排列是洗痰碎痰法、胰酶均質(zhì)化、生理鹽水洗滌法。洗痰碎痰法與胰酶均質(zhì)化法比較陽性率接近，無顯著性差異（P > 0.05）。生理鹽水洗滌法與其他兩種方法比較，陽性率雖略低，但亦無顯著性差異（P > 0.05）。

生理鹽水洗滌法簡便易行，但由于試管面積不夠大，洗痰不夠徹底，痰在試管內(nèi)不易搖碎，接種時(shí)不一定能得到真正的感染菌或致病菌；另外痰標(biāo)本多次移動(dòng)，容易丟失最有價(jià)值的部分，操作時(shí)需要非常小心。

痰均質(zhì)化法中胰酶溶液是臨床實(shí)驗(yàn)室最常使用的痰消化液，價(jià)廉效果好，對細(xì)菌生長幾無影響，但消化耗時(shí)較長，應(yīng)用液常溫下不易保存（配制后-20℃僅保存10 d），且反復(fù)凍融容易失效，臨用前配制效果更好。α-糜蛋白酶溶液消化能力更強(qiáng)，消化所需時(shí)間更短，但價(jià)格昂貴，成本較高。二硫蘇糖醇溶液（SPUTASOL消化液）和N-乙酰-L-半胱氨酸溶液方便保存，效期較長，已有配制好的商品試劑出售，但對細(xì)菌生長有輕微的抑制作用。柯俊等[5]報(bào)道痰標(biāo)本采用SPUTASOL消化液預(yù)處理的時(shí)間對流感嗜血桿菌的檢出率有較大影響，消化液處理后15 min接種比30 min后接種流感嗜血桿菌的檢出率要高。

洗痰碎痰法方法操作簡單，材料易得，不需要特殊試劑，成本低廉，耗時(shí)很短，處理后的標(biāo)本幾乎沒有雜菌干擾，建議在細(xì)菌室預(yù)處理痰標(biāo)本時(shí)推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 葉應(yīng)嫵，王毓三，申子瑜. 全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程[M]. 第3版.南京：東南大學(xué)出版社，2006：744-745.

[2] 陳東科，孫長貴. 實(shí)用臨床微生物學(xué)檢驗(yàn)與圖譜[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：145-146.

[3] 宣瑞紅，胡朝暉，王娟，等. 臨床標(biāo)本軍團(tuán)菌分離方法研究[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（6）：593-594.

[4] 王惠萱，李雪梅，滕毅，等. 臨床痰標(biāo)本檢驗(yàn)前期處理新方法研究[J]. 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（8）：898-899.

[5] 柯俊，陳媛，陶治洲，等. 痰標(biāo)本預(yù)處理對細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的影響[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，5（13）：814-815.

（收稿日期：2012-12-08）