腦梗死復(fù)發(fā)患者血小板活化及阿司匹林抵抗研究

[摘要] 目的 探討在腦梗死復(fù)發(fā)的治療中血小板白細(xì)胞聚集體（PLA）、血小板聚集和阿司匹林抵抗（AR）的重要作用。 方法 在入院當(dāng)天對(duì)58例復(fù)發(fā)組腦梗死患者和116例初發(fā)組腦梗死患者采用1∶2配對(duì)法，對(duì)其血小板聚集率和PLA水平進(jìn)行測(cè)定。每晚開始頓服拜阿司匹林200 mg，連續(xù)頓服7～10 d后，通過再次測(cè)量患者的血小板聚集率，挑選出具有阿司匹林抵抗的患者。 結(jié)果 在入院當(dāng)天的血小板聚集率測(cè)定結(jié)果和PLA水平均表現(xiàn)為復(fù)發(fā)組高于初發(fā)組患者，在持續(xù)頓服7～10 d的拜阿司匹林后，阿司匹林抵抗發(fā)生率也表現(xiàn)為復(fù)發(fā)組高于初發(fā)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。 結(jié)論 阿司匹林抵抗和血小板活化在腦梗死復(fù)發(fā)過程中可能起著重要作用，可能是腦梗死復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素之一。因此在腦梗死患者的二級(jí)預(yù)防中服用阿司匹林期間有必要進(jìn)行血小板聚集率的檢查，盡早發(fā)現(xiàn)和識(shí)別AR，及時(shí)調(diào)整二級(jí)預(yù)防策略。

[關(guān)鍵詞] 阿司匹林抵抗；血小板活化；血小板白細(xì)胞聚集體；腦梗死；復(fù)發(fā)

[中圖分類號(hào)] R743.3[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）10-0053-03

The study of platelet activation and aspirin resistance in patients with recurrent cerebral infarction

PAN Xiaoyun1 YI Xingyang2 CHI Lifen2 PAN Jibao3

1.Department of Internal Medicine， Ruian Hospital of Traditional Chinese Medicine， Ruian 325200， China; 2.Department of Neurology， Ruian People’s Hospital， Ruian 325200， China; 3.Department of Laboratory， Ruian People’s Hospital， Ruian 325200， China

[Abstract] Objective To investigate roles of platelet-leukocyte aggregation， platelet aggregation and aspirin resistance in patients with recurrent cerebral infarction. Methods The platelet aggregation rate and the levels of PLA were performed in 58 patients with recurrent cerebral infarction and 116 patients with the first onset of cerebral infarction on the first day of admission， then aspirin tablets 200 mg were taken by patients every night. The platelet aggregation rate was performed again after 7-10 days， and the patients of aspirin resistance were screened. Results The platelet aggregation rate and the levels of PLA in patients with recurrent cerebral infarction were significantly higher than those of patients with first onset of cerebral infarction. The incidence of aspirin resistance in patients with recurrent cerebral infarction was significantly higher than that of patients with first onset of cerebral infarction (P ＜ 0.05). Conclusion Aspirin resistance and platelet activation may play an important role in the process of recurrence of cerebral infarction， and may be important risk factors for recurrence of cerebral infarction， so it is necessary to check the platelet aggregation rate in patients with cerebral infarction during taking aspirin for the secondary prevention， to find and identify AR earlier， and adjust secondary prevention strategies.

[Key words] Aspirin resistance; Activation of platelet; Platelet-leukocyte aggregation; Cerebral infarction; Recurrence

腦梗死是一種發(fā)病率、致殘率很高的疾病，嚴(yán)重影響人類健康并且復(fù)發(fā)率高，每年約有4%～14%患者復(fù)發(fā)，早期復(fù)發(fā)率達(dá)30%，腦梗死復(fù)發(fā)者預(yù)后往往不良。作為一種有效的抗血小板聚集藥，阿司匹林廣泛應(yīng)用于心腦血管事件的二級(jí)預(yù)防及某些經(jīng)過選擇的患者的一級(jí)預(yù)防，但長(zhǎng)期服用仍有可能發(fā)生動(dòng)脈血栓形成事件。本文采用1∶2配對(duì)方法，對(duì)入住我院及瑞安市人民醫(yī)院的58例復(fù)發(fā)腦梗死患者和116例初發(fā)腦梗死患者的血小板聚集、血小板白細(xì)胞聚集體（PLA）進(jìn)行檢測(cè)，從實(shí)驗(yàn)室中探討血小板活化和阿司匹林抵抗在腦梗死復(fù)發(fā)中的重要作用。

1資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 復(fù)發(fā)腦梗死組因再次發(fā)生腦梗死在48 h內(nèi)入住我院及瑞安市人民醫(yī)院的患者。入選標(biāo)準(zhǔn)：①既往有腦梗死病史；②新出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀；③初發(fā)癥狀、體征加重，且排除進(jìn)展性卒中；④上述情況均經(jīng)頭顱CT或MRI證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①心源性腦栓塞患者；②近1周內(nèi)使用過氯吡格雷、傳統(tǒng)非甾體抗炎藥（除阿司匹林以外）、華法令、低分子肝素等影響血小板聚集功能的藥物；③有出血疾病史，包括家族或個(gè)人；④短期內(nèi)有嚴(yán)重外傷或者進(jìn)行較大外科手術(shù)的患者；⑤血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L或＞450×109/L的患者；⑥患有骨髓增生異常綜合征的患者。經(jīng)篩選后共有58例患者入選，其中男36例，女22例，年齡43～88歲，平均（73.64±8.54）歲。有51例患者為復(fù)發(fā)1次，7例患者為復(fù)發(fā)2次及以上。

1.1.2 初發(fā)腦梗死組腦梗死患者首次發(fā)病在48 h內(nèi)入住本院及瑞安市人民醫(yī)院進(jìn)行治療，患者經(jīng)過CT和/或MRI檢驗(yàn)，全部腦梗死病例的診斷結(jié)果均符合全國(guó)第五屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。初犯腦梗死的患者入院標(biāo)準(zhǔn)同1.1.1中復(fù)發(fā)腦梗死患者篩選標(biāo)準(zhǔn)一致。兩組采用2∶1配對(duì)方法對(duì)患者進(jìn)行篩選，與復(fù)發(fā)性腦梗死患者區(qū)別，確定患者同期住院（±1周）、年齡（＜2歲）、病情的嚴(yán)重程度以神經(jīng)功能缺損程度為主、NIHSS評(píng)分＜5分的為主，患者均有糖尿病、TIA史、高血壓、吸煙等相同的危險(xiǎn)因素，共116例，其中男72例，女44例，年齡43～89歲，平均（73.58±9.42）歲。

1.1.3 對(duì)照組選擇同期無心、腦、肝、腎疾病的健康體檢者42名（男24名，女18名），年齡41～82歲，平均（70.8±11.8）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)同上述兩組。

1.2 危險(xiǎn)因素判定

對(duì)入組患者詳細(xì)了解年齡、性別、高血壓、冠心病、糖尿病、TIA史、酗酒、吸煙等相關(guān)危險(xiǎn)因素，并于入院次日晨采空腹靜脈血檢測(cè)血糖、血脂水平。

1.3 血小板聚集率測(cè)定

1.3.1 儀器與試劑PACKS-4型四通道血小板聚集儀及誘導(dǎo)劑（美國(guó)Helena公司），誘導(dǎo)劑分別為二磷酸腺苷（ADP，Helena公司）5.0 μmol/L、花生四烯酸（AA，Helena公司）500 μg/mL。

1.3.2 血小板聚集率測(cè)定方法入組患者于入院當(dāng)天及第7～10天抽肘前靜脈血，在抽血時(shí)盡量避免與玻璃器皿接觸，抽取6 mL靜脈血注入含3.8%枸櫞酸鈉660 μL的試管中，經(jīng)過3次倒置混勻后立即送檢。以1000 r/min的速度對(duì)抽取的新鮮血標(biāo)本離心10 min，得到富含血小板血漿提取物（platelet-rich plasma，PRP）。將PRP調(diào)節(jié)到（200～300）×109/L，以4000 r/min再對(duì)剩余血液離心10 min，制備出乏血小板血漿（platelet-prro plasma，PPP），將PPP血小板計(jì)數(shù)調(diào)整到（10～20）×109/L。分別取出兩只比濁管，將PRP 225 μL和PPP 250 μL分別加入，在血小板聚集儀中分別將PRP和PPP的透光度調(diào)節(jié)為90和10。再將比濁管置于37℃溫浴3～5 min后，分別將25 μL AA和10 μL ADP加入到PRP中，使兩者的最終濃度分別為0.5 mg/mL和10 μmol/L，記錄最大血小板聚集率（maximum platelet aggregation rate，MAR），整個(gè)測(cè)定時(shí)間在3 h內(nèi)完成。

1.3.3 阿司匹林抵抗的判斷入院當(dāng)天開始服用拜阿司匹林（拜耳公司提供，國(guó)藥準(zhǔn)字J20080078）200 mg，每晚頓服，連續(xù)服用7～10 d后分別以AA和ADP作為誘導(dǎo)劑測(cè)定血小板聚集率。符合下述兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)者稱為阿司匹林抵抗：在0.5 mg/mL AA濃度下MAR≥20%；在10 μmol/L ADP濃度下MAR≥70%。

1.4 PLA檢測(cè)

1.4.1 儀器及試劑FC 500 MPC型流式細(xì)胞儀及Q-PREP溶血儀（美國(guó)Beckman Coulter公司產(chǎn)品），用MPX cytometer軟件處理數(shù)據(jù)。鼠抗人CD41-FITC、同型對(duì)照IgG1-FITC、鼠抗人CD45-PC5（美國(guó)Coulter Immunotech公司產(chǎn)品）。

1.4.2 血液標(biāo)本采集采血時(shí)不能用壓脈帶，且棄開始2 mL血，以免因穿刺引起血小板活化而影響結(jié)果。

1.4.3 PLA的檢測(cè)方法入組者在入院當(dāng)天在肘靜脈采血3 mL放入EDTA-K2抗凝血試管中，標(biāo)本采血后2 h內(nèi)檢測(cè)。取試管2支，一管加入CD45-PC5 5 μL、CD41-FITC 10 μL，另一管加入CD45-PC5 5 μL、IgG1-FITC 10 μL，分別加入100 μL EDTA-K2抗凝全血混勻，室溫暗處孵育15 min后在Q-PREP溶血儀上溶血，加入1 μL PBS緩沖液混勻，2 500 r/min離心5 min后棄上清夜，加入1 μL PBS液混勻后在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)。使用CD45-PC5/SSC設(shè)門，將外周血白細(xì)胞分為中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞三群細(xì)胞，調(diào)整非特異性結(jié)合在0.8%～1.5%，分別記錄血小板粒細(xì)胞聚集體（PNA）、血小板單核細(xì)胞聚集體（PMA）、血小板淋巴細(xì)胞聚集體（PLyA）和PLA。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析及q檢驗(yàn)，P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般情況和危險(xiǎn)因素比較

兩組患者在年齡、性別、高血壓病、糖尿病、TIA病史、吸煙、酗酒以及入院時(shí)的血糖、血脂、神經(jīng)功能缺損程度等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般情況和危險(xiǎn)因素比較

注：兩組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞ 0.05）

2.2 兩組患者血小板聚集率和阿司匹林抵抗發(fā)生率比較

復(fù)發(fā)組患者在入院當(dāng)天測(cè)定的血小板聚集率和PLA水平均高于初發(fā)組患者，在持續(xù)頓服7～10 d的拜阿司匹林后，阿司匹林抵抗發(fā)生率也表現(xiàn)為復(fù)發(fā)組高于初發(fā)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表2。

2.3 兩組患者PLA比較

兩組患者入院時(shí)PLA、PMA、PNA、PLyA表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，復(fù)發(fā)組患者又高于初發(fā)組患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表3。

表3 復(fù)發(fā)性腦梗死患者和初發(fā)腦梗死患者及對(duì)照者PLA比較（x±s，%）

注：#與初發(fā)組比較，P ＜ 0.05；*與對(duì)照組比較，P ＜ 0.05

3 討論

3.1 血小板活化在腦梗死和腦梗死復(fù)發(fā)中的作用

在急性缺血性腦血管病的發(fā)生發(fā)展過程中動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成起著重要作用，而血小板活化是動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成的主要機(jī)制[1]。Htun P等[2]研究發(fā)現(xiàn)，腦梗死患者3個(gè)月后CD62P表達(dá)處于較高狀態(tài)，提示血小板活化在腦梗死復(fù)發(fā)中起著重要作用。目前檢測(cè)血小板活化的指標(biāo)較多，如血小板聚集率、P-選擇素等。近年來血小板白細(xì)胞聚集體（PLA）的研究越來越引起眾多學(xué)者的關(guān)注。Michelson AD等[3]研究表明外周血中PLA特別是PMA與P-選擇素相比是血小板活化更加敏感的指標(biāo)。流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)的應(yīng)用為評(píng)價(jià)血小板在體內(nèi)活化程度提供了可靠方法[4]。本研究結(jié)果顯示：入院時(shí)初發(fā)腦梗死和復(fù)發(fā)性腦梗死患者血小板聚集率和PLA均明顯高于對(duì)照組，復(fù)發(fā)性腦梗死患者又高于初發(fā)腦梗死患者，提示血小板活化在腦梗死的發(fā)病和腦梗死復(fù)發(fā)中可能發(fā)揮重要作用。說明復(fù)發(fā)性腦梗死患者的血小板處于較高的活化狀態(tài)，這與Htun P等報(bào)道結(jié)果相符。腦動(dòng)脈硬化、血管內(nèi)皮損傷、膠原暴露使血小板黏附，同時(shí)血管內(nèi)皮造成局部血流動(dòng)力學(xué)改變，產(chǎn)生高切變力以及脂肪斑塊破潰，使血小板活化[5]。血小板和白細(xì)胞活化后，其表面的黏附分子表達(dá)增加，黏附分子與配體相互結(jié)合和（或）通過纖維蛋白原在黏附分子之間的橋接作用形成PLA。PLA形成后，通過血小板的橋接作用，促使白細(xì)胞與局部損傷內(nèi)皮細(xì)胞處黏附、滾動(dòng)和滲出，進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞下，促使內(nèi)膜炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化和附壁血栓形成的發(fā)生發(fā)展[6]。另外PLA形成的微血栓可以阻塞小血管，并釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，在腦的缺血/再灌注損傷中起重要作用，因而在腦梗死復(fù)發(fā)中也可能發(fā)揮重要作用。

3.2 阿司匹林抵抗與腦梗死的復(fù)發(fā)

20世紀(jì)60年代以后發(fā)現(xiàn)阿司匹林有較好的抗血栓作用而被廣泛用于腦梗死的預(yù)防。阿司匹林憑借著其潛在的抗動(dòng)脈粥樣硬化能力仍然是臨床上對(duì)于血管事件一級(jí)預(yù)防和二級(jí)預(yù)防的首選治療用藥。阿司匹林用于抗血小板聚集的作用機(jī)制是使環(huán)氧化酶-1（COX-1）的活性部位絲氨酸-529不可逆乙?；?，從而導(dǎo)致COX-1永久失活，減少血小板中血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）的生成從而抑制血小板活化和聚集。然而阿司匹林的抗血小板作用存在著個(gè)體差異。在口服常規(guī)劑量阿司匹林的患者中，有部分患者無明顯療效，仍發(fā)生血栓栓塞事件，這些患者可能存在阿司匹林抵抗（aspirin resistance，AR）。Bennett D等[7]研究提到阿司匹林抵抗是復(fù)發(fā)性心肌梗死的重要危險(xiǎn)因素，至于其是否為腦梗死復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素還缺乏證據(jù)。這方面的研究國(guó)內(nèi)外均報(bào)道少。

本研究發(fā)現(xiàn)，服用拜阿司匹林7～10 d后復(fù)發(fā)性腦梗死患者阿司匹林抵抗發(fā)生率明顯高于初發(fā)患者。上述結(jié)果提示：阿司匹林抵抗在腦梗死復(fù)發(fā)過程中可能起著重要作用，可能是腦梗死復(fù)發(fā)的重要危險(xiǎn)因素之一。目前AR發(fā)生的確切機(jī)制尚未完全明了，可能與下列因素相關(guān)：①對(duì)血小板環(huán)氧化酶-1（COX-1）的抑制減弱：實(shí)驗(yàn)證明小劑量（50～325 mg）阿司匹林即可阻滯95%的血小板COX-1活性，達(dá)到防治目的，而有些患者在服用大劑量（＞1000 mg）阿司匹林后仍為“抵抗”，效果也往往很不理想[8]。②非甾體抗炎藥的影響：非甾體抗炎藥與COX-1的某些部位有較強(qiáng)的親和力，與阿司匹林競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合COX-1，使阿司匹林不能乙酰化COX-1?，F(xiàn)已證明，非甾體消炎藥中的布洛芬、吲哚美辛、萘普生、噻洛芬酸能阻斷阿司匹林的抗血小板效應(yīng)，導(dǎo)致繼發(fā)性阿司匹林抵抗[9]。③不同的個(gè)體之間可能存在COX-1基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）現(xiàn)象，這種多態(tài)性可影響COX-1蛋白結(jié)構(gòu)，改變阿司匹林作用活化位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，從而阻礙阿司匹林的乙?；饔?，使其對(duì)阿司匹林產(chǎn)生的抑制效果敏感性極不均一。這可能是某些患者產(chǎn)生阿司匹林抵抗的結(jié)構(gòu)學(xué)基礎(chǔ)。④COX-2為誘導(dǎo)型環(huán)氧化酶，主要存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在被阿司匹林抑制后很快被誘導(dǎo)合成，從而誘導(dǎo)血小板聚集。不同患者的血小板COX-2表達(dá)程度不同，當(dāng)有炎癥刺激時(shí)，COX-2在有核細(xì)胞中的表達(dá)可增強(qiáng)10～20倍，而阿司匹林對(duì)COX-2的抑制作用比COX-1低170倍。這些提示，在動(dòng)脈粥樣硬化等炎癥過程中，COX-2過度表達(dá)可能是阿司匹林抵抗的原因之一[10]。⑤血小板GpⅡb/Ⅲa、GpⅠa、GpⅠb的基因多態(tài)性及吸煙、糖尿病、高脂血癥、應(yīng)激等各種因素均會(huì)影響到血小板的聚集率，與阿司匹林抵抗相關(guān)。

有研究表明阿司匹林抵抗患者的死亡、心肌梗死或缺血性卒中風(fēng)險(xiǎn)是阿司匹林敏感者的3倍[11]。因此在腦梗死患者的二級(jí)預(yù)防中服用阿司匹林期間有必要進(jìn)行血小板聚集率的檢查，盡早發(fā)現(xiàn)和識(shí)別AR，及時(shí)調(diào)整二級(jí)預(yù)防策略。對(duì)阿司匹林有抵抗患者如何處理目前尚無明顯有效的特異性治療策略?？赡苡行У闹委煼椒ǎ孩僭龃蟀⑺酒チ謩┝浚河醒芯勘砻?，增加阿司匹林的劑量不能改善所有阿司匹林抵抗，相反，劑量增大可能會(huì)增高繼發(fā)性出血和胃腸道潰瘍等不良反應(yīng)發(fā)生率。②換用其他的抗血小板藥物，如氯吡格雷。有人提出對(duì)于阿司匹林可耐受但治療無效時(shí)，可應(yīng)用阿司匹林+緩釋型雙嘧達(dá)莫進(jìn)行二級(jí)預(yù)防；對(duì)于不能耐受阿司匹林的患者，建議單用氯吡格雷[12]。

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（收稿日期：2011-12-22）