蛻膜NK細(xì)胞KIR的基因分型與原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)病機制的研究

[摘要] 目的 探討免疫因素中蛻膜NK細(xì)胞KIR的基因分型對原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)病機制。 方法 選擇正常妊娠組28例孕產(chǎn)婦作為對照組，選擇同期住院治療的原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)（三次以上不明原因的早期流產(chǎn)、并無活胎及中期流產(chǎn)史）為代表的病理妊娠組28例，分析兩組的基因位點分布情況。 結(jié)果 發(fā)現(xiàn)14種KIR基因在URSA組與對照組蛻膜組織中均以不同頻率表達(dá)，其中KIR2DL1、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3的基因頻率均為100％；與對照組相比，RSA組蛻膜組織中KIR3DS1、KIR2DS5的基因頻率顯著升高，KIR2DL2的基因頻率顯著降低，其他KIR基因位點未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論 蛻膜NK細(xì)胞KIR的基因分型與原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 蛻膜NK細(xì)胞；KIR的基因分型；原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)

[中圖分類號] R714.21[文獻標(biāo)識碼] A[文章編號] 1673-9701（2012）10-0038-03

The correlation of unexplained habitual abortion pathogenesis with NK cells and KIR genotyping

ZHANG Jinmin1 YANG Chunbo2

1.Department of Obstetrics and Gynecology，Maternal and Child Healthcare Hospital of Xianju County in Zhejiang Province， Xianju 317300， China; 2.Department of Obstetrics and Gynecology， Affiliated Obstetrics and Gyneclolgy Hospital of School of Medicine， Zhejiang University， Hangzhou 310006， China

[Abstract] ObjectiveTo study the immune factors in decidual NK cells in KIR genotyping of unexplained habitual abortion pathogenesis. Methods To selcet he normal pregnancy group 28 pregnant women as a control group， and to choose the same period of hospitalization unexplained recurrent miscarriages (three more unexplained early abortion; and medium-term abortion was not the history of live births)， represented by the group of 28 pathological pregnancy. Comparative analysis of two loci distribution. Results tourteenkinds of KIR genes in URSA group and control group were different in the frequency of decidual expression， including KIR2DL1， KIR2DL4， KIR3DL2， KIR3DL3 gene frequency was 100%; compared with the control group， RSA group decidua in KIR3DS1， KIR2DS5 gene frequency was significantly increased， KIR2DL2 gene frequency was significantly reduced， the other KIR loci found no significant difference. Conclusion decidual NK cells and KIR genotyping unexplained habitual abortion is closely related.

[Key words] Decidual NK cells; KIR genotyping; Unexplained habitual abortion

原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion， RSA）的發(fā)病因素除了常規(guī)的解剖、遺傳、內(nèi)分泌及感染四大原因外，尚有很大比例與免疫因素密切相關(guān)[1]。母胎界面中滋養(yǎng)層細(xì)胞表達(dá)的HLA分子及蛻膜組織的免疫細(xì)胞在維持正常妊娠中起著重要作用。隨著近年來NK受體理論的快速發(fā)展，研究者對NK細(xì)胞表面受體的作用已經(jīng)初步達(dá)到共識；然而至今蛻膜局部KIR－HLAⅠ組合的分布格局仍不清楚，因此很大程度上影響了對蛻膜免疫細(xì)胞功能的評價以及對母胎免疫耐受機制的研究[2]。因此，研究正常和病理妊娠下，母體KIR受體分布格局及與配體HLA I類分子多態(tài)性的組合具有重要的臨床意義[3]。本研究以母胎界面KIR－HLAⅠ組合多態(tài)性為切入點，在基因及蛋白水平分析KIR－HLAⅠ組合多態(tài)性，研究原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)病機制。旨在闡明原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)的發(fā)病機制，為臨床上腫瘤、自身免疫病的免疫治療以及預(yù)防器官移植排斥反應(yīng)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

選擇2007年1月~2008年1月我院住院進行產(chǎn)檢的（至少有一順產(chǎn)孩子）正常妊娠組28例孕產(chǎn)婦作為對照組，選擇同期住院治療的原因不明習(xí)慣性流產(chǎn)（3次以上不明原因的早期流產(chǎn)；并無活胎及中期流產(chǎn)史）為代表的病理妊娠組28例，年齡19～35歲。正常妊娠組（對照組）年齡18～34歲，兩組年齡等一般資料比較，差異無顯著性意義（P ＞ 0.05），具有可比性。

1.2 實驗儀器

①DU800紫外分光光度計：美國Beckman公司；②MDF-U4086S超低溫冰箱：美國SANYO公司；③Microfug-22R低溫高速離心機：美國Beckman公司；④GIS-2010凝膠成像掃描系統(tǒng)（紫外）：Tanon公司；⑤GeneAmp PCR System 9600 PCR擴增儀：PERKIN ELMER公司；⑥H6-1微型電泳儀：美國BIO-RAD公司；⑦熒光定量 PCR儀：Rouch Lightcycler；⑧流式細(xì)胞儀：美國Beckman Coulter公司；⑨激光共聚焦顯微鏡（CLSM）：Nikon公司；⑩熒光倒置顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蛻膜組織及絨毛組織單個核細(xì)胞的分離新鮮蛻膜組織及絨毛組織獲自正常妊娠組和病理妊娠組婦女，洗去血液，剔除血管組織，剪碎，于玻璃研磨器內(nèi)研磨，組織懸液過200目銅網(wǎng)，收集濾過的細(xì)胞懸液，用淋巴細(xì)胞分離液分離出單個核細(xì)胞，用PBS洗2次。

1.3.2 鹽析法抽提DNA在上述獲得的單個核細(xì)胞懸液中加裂解液破壞細(xì)胞膜，裂解30 min后離心二次再加入表面活性劑蛋白酶K消化蛋白，然后再加入20% SDS和6 M NaCl充分沉淀，最后用氯仿-酚抽提，無水乙醇清洗沉淀DNA。

1.3.3 PCR-SSP方法檢測蛻膜KIR參照文獻[4]，合成特異性引物，經(jīng)BLAST驗序正確后，用PCR/SSP方法對蛻膜KIR進行基因位點低分辨率檢測和單倍型分析。序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(sequence specific primer polymerase chain reaction，PCR．SSP)檢測蛻膜組織KIR基因，反應(yīng)體系20 μL，含dNTP終濃度2 mmoL/L，MgCI2 2 mmol/L，引物終濃度214．3 nmol／L。反應(yīng)條件：96℃ 1 min，96℃ 25 s，65℃ 45 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；96℃ 25 s，60℃ 45 s，72℃ 30秒，21個循環(huán)；96℃ 25秒，55℃ 1 min，72℃ 2 min，5個循環(huán)；72℃ 10 min。以KIR框架基因3DL2、3DL3、2DL4為內(nèi)參照，不含DNA的PCR體系作陰性對照，所有樣本重復(fù)測定2次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

KIR、HLA-C基因檢出頻率計算：檢出個數(shù)／總數(shù)，應(yīng)用SPSS15．0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析。P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

蛻膜組織KIR基因頻率用PCR-SSP法進行KIR基因分型，檢測了迄今發(fā)現(xiàn)的14種KIR基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)14種KIR基因在URSA組與對照組蛻膜組織中均以不同頻率表達(dá)，其中KIR2DL1、KIR2DL4、KIR3DL2、KIR3DL3的基因頻率均為100％；與對照組相比，病理妊娠組（RSA）蛻膜組織中KIR3DS1、KIR2DS5的基因頻率顯著升高（P ＜ 0.05），KIR2DL2的基因頻率顯著降低（P ＜ 0.05），其他KIR基因位點未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異（P ＞ 0.05）。

3 討論

近年來“NK細(xì)胞受體”理論的迅速發(fā)展為我們研究NK細(xì)胞的功能提供了新的思路。大量研究證實，NK細(xì)胞表達(dá)能夠特異性識別HLA I類分子的NK細(xì)胞受體，包括免疫球蛋白樣受體（Ig-like receptors，KIR）、免疫球蛋白樣轉(zhuǎn)錄物（Immunoglobulin like transcripts，ILT）和C-型凝集素樣受體（C-type lectin receptors）三大類[5]。其中，KIR以其豐富的多態(tài)性尤為學(xué)者矚目。KIR多態(tài)性表現(xiàn)在兩個方面：其一，KIR的基因數(shù)目在不同NK細(xì)胞克隆、不同個體有差異，不同的個體可表現(xiàn)為不同的單元型。目前發(fā)現(xiàn)的單元型有兩種組合，即以含有單一活化性KIR基因2DS4為特征的A型（A-haplotype）和以含有多種活化性KIR基因為特征的B型(B-haplotype)。其二，KIR的多態(tài)性還表現(xiàn)在同一KIR基因座位有多個不同等位基因，其中大多數(shù)為非同義突變。研究發(fā)現(xiàn)，各等位基因與不同配體的結(jié)合力不一樣，從而影響其對NK細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[6]。

與KIR對應(yīng)的HLAⅠ分子同樣具有多態(tài)性。根據(jù)α1結(jié)構(gòu)域77/80位含有不同氨基酸殘基，HLA-C同種異型分子可以分為兩組，第1組HLA-C的α重鏈第77位和第80位分別為絲氨酸和天冬酰胺殘基，包括HLA-Cw1、-Cw3、-Cw7、-Cw8、-Cw13和HLA-Cw14；第2組HLA-C的α重鏈第77位和第80位分別為天冬氨酸和賴氨酸殘基，包括HLA-Cw2、-Cw4、-Cw5、-Cw6、-Cw15、-Cw17、-Cw18。 HLA-G基因多態(tài)性包括編碼區(qū)的多態(tài)性和非編碼區(qū)的多態(tài)性。HLA-G基因編碼區(qū)的多態(tài)性有限，主要表現(xiàn)為外顯子2、3、4內(nèi)單個核苷酸位點的突變和缺失，僅有15個等位基因，且多為同義突變，不改變HLA-G分子的二級結(jié)構(gòu)，對HLA-G分子功能也無影響。HLA-G基因非編碼區(qū)的多態(tài)性包括5’調(diào)控序列的多態(tài)性和3’非翻譯區(qū)的多態(tài)性，與HLA-G分子的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，部分決定HLA-G分子是否表達(dá)及表達(dá)的水平， 影響HLA-G分子的功能，并與病理性妊娠關(guān)系密切。單獨或共表達(dá)在NK細(xì)胞上的KIR受體通過識別、結(jié)合相應(yīng)的HLA I類分子配體，傳遞活化性或抑制性信號，協(xié)同調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞活性來維持母胎免疫耐受。另一方面，HLAⅠ分子對于蛻膜NK細(xì)胞表面受體的表達(dá)起著誘導(dǎo)調(diào)節(jié)的作用[7-8]。

以往對RSA發(fā)病機制的免疫機制遺傳學(xué)方面的研究多局限于母胎界面HLA多態(tài)性的分析，而忽略了uNK細(xì)胞表面KIR受體的分析。而這也許就是問題的關(guān)鍵所在。試想占蛻膜局部絕大多數(shù)的uNK細(xì)胞表面表達(dá)眾多KIR受體，通過識別、結(jié)合滋養(yǎng)層細(xì)胞表面相應(yīng)的HLAⅠ分子，向胞內(nèi)傳遞著活化及抑制信號，直接調(diào)節(jié)著uNK細(xì)胞的活性：包括關(guān)鍵細(xì)胞因子的分泌，細(xì)胞殺傷活性的調(diào)節(jié)。而這局部微環(huán)境的改變將最終影響著妊娠成敗的結(jié)局。因此， KIR－HLAⅠ類分子分布格局的研究意義顯而易見[9-11]。

為此，本課題擬在原有工作基礎(chǔ)上，以母胎界面KIR－HLAⅠ組合多態(tài)性為切入點，首先從基因水平上進行KIR－HLAⅠ組合多態(tài)性研究，其次在蛋白水平上檢測KIR－HLAⅠ的表達(dá)水平，觀察uNK細(xì)胞的活性狀態(tài)。

相信隨著這些問題的解決，可以讓我們更全面、更深層次地理解KIR－HLAⅠ組合多態(tài)性在母胎界面誘導(dǎo)維持母胎免疫耐受中所起的作用。這不僅為闡述RSA的發(fā)病機制提供新的理論基礎(chǔ)，也可能為臨床上免疫治療RSA提供新的思路。

[參考文獻]

[1]Gómez-Lozano N，Vilches C. Genotyping of human killer-cell immunoglobulin primers：An update[J]. Tissue Antigens， 2002， 59(3):184-193.

[2]Norman PJ，Stephens HA，Verity DH，et al. Distribution of natural killer cell immunoglobulin-like receptor sequences in three ethnic groups[J]. Immunogenetics，2001，52（3-4）：195-205.

[3]Hsu KC， Liu XR， Selvakumar A，et al. Killer Ig-like receptor（KIR）haplotype analysis by gene content: evidence for genomic diversity with a minimum of six basic framework haplotypes，each with multiple subsets[J]. J Immunol，2002，169（9）：5118-5129.

[4]Moffett-King A. Natural killer cells and pregnancy[J]. Nat Revs Immunol， 2002，2（64）：332-333.

[5]King A，Burrows TD，Hiby SE，et al. Expression of HLA-C antigen by human extravillous trophoblast[J]. Placenta，2000，21（13）：376-387.

[6]Toneva M， Lepage V，Lafay G，et al. Genomic diversity of natural killer cell receptors genes in three populations[J]. Tissue antigen，2001，57（27）：358-362.

[7]Borrego F， Kabat J， Kim DK， et al. Structure and function of major histocompatibility complex (MHC) class I specific receptors expressed on human natural killer (NK) cells[J]. Mol Immunol， 2001，38（24）：637-660.

[8]Hsu KC， Liu XR， Selvakumar A，et al. Killer Ig-like receptor (KIR) haplotype analysis by gene content: evidence for genomic diversity with a minimum of six basic framework haplotypes，each with multiple subsets[J]. J Immunol，2002，169（6）：5118-5129.

[9]Bainbridge DRJ， Ellis SA，Sargent IL. Little evidence of HLA-G polymorphism in Caucasian or Afro-Caribbean populations[J]. J Immul，1999，163（41）：2023-2027.

[10]Middleton D，Curran M，Maxwell L. Natural killer cells and their receptors[J]. Transpl Immunol，2002，10（2-3）：147-164.

[11]Le Maoult J， Zafaranloo K， Le Danff C， et al. HLA-G up-regulates ILT2， ILT3， ILT4，and KIR2DL4 in antigen presenting cells，NK cells， and T cells[J]. Faseb J，2005，19（6）：662-664.

（收稿日期：2011-08-18）