玉米種質(zhì)資源RAPD分子標(biāo)記優(yōu)化體系的建立

摘要：玉米是我國(guó)重要的作物之一，在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。吉林省玉米生產(chǎn)條件優(yōu)越，推廣面積廣，品種的多樣性豐富，為實(shí)現(xiàn)品種的管理高效科學(xué)，本實(shí)驗(yàn)以用玉米為材料進(jìn)行RAPD的研究。建立并優(yōu)化了高效、穩(wěn)定的玉米R(shí)APD實(shí)驗(yàn)體系，為后續(xù)玉米品種的管理提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)支持。

關(guān)鍵詞：玉米；RAPD；體系

中圖分類號(hào)：S513 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1674-0432（2012）-10-0050-1

RAPD（random amplified polymorphic DNA，RAPD）也稱之為AP-PCR（Arbitrary Primer PCR），即隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)，是由Williams和Welsh等發(fā)明的分子標(biāo)記技術(shù)，是一項(xiàng)基于PCR技術(shù)的分子生物技術(shù)[1，2]。是以基因組DNA為模板，常以一個(gè)10mer隨機(jī)的寡核苷酸序列作引物，通過PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生許多不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，以檢測(cè)DNA序列的多態(tài)性。它可以在物種遺傳背景沒有任何分子生物學(xué)研究的情況下，對(duì)其進(jìn)行基因組指紋圖譜進(jìn)行研究，還可用于檢測(cè)體細(xì)胞雜種和微生物分型[3]。

玉米是最為古老的栽培作物之一，目前為我國(guó)栽培作物的第二位。吉林省是我國(guó)的玉米大省，玉米種植面積在全國(guó)位于前五，每年審定的新品種數(shù)目為全國(guó)第一。由于目前玉米為品種檢定手段還不完善，導(dǎo)致品種管理有一定的難度。故本文進(jìn)行了玉米R(shí)APD分子標(biāo)記體系的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

購(gòu)買市售玉米主推品種種子。

1.2 試驗(yàn)試劑和儀器

TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer（含Mg2+）、10堿基隨機(jī)引物、dNTPs；瓊脂糖、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（D2000Maker）等購(gòu)自上海生工。

1.3 RAPD方法

1.3.1 DNA的提取 以玉米種子產(chǎn)生的嫩芽為材料，使用植物基因組試劑盒提取。DNA回溶于滅菌水中，-20℃保存?zhèn)溆茫?%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量。

1.3.2 RAPD條件及擴(kuò)增程序 根據(jù)王志剛[4]RAPD反應(yīng)體系文獻(xiàn)，玉米R(shí)APD初始25μL反應(yīng)體系包括：2.5μL 10×PCR Buffer、0.2μmol·L-1引物、0.5U Taq DNA聚合酶、0.1 mmol·L-1dNTPs、20ng模板DNA，用ddH2O補(bǔ)齊反應(yīng)體系到25μL。

RAPD-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min，94℃變性50s，38℃退火40s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸10min，4℃保存。

1.3.3 RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化 模板DNA濃度，TaqDNA聚合酶濃度、引物濃度、dNTP定量對(duì)影響RAPD反應(yīng)結(jié)果影響較大須進(jìn)行優(yōu)化。本試驗(yàn)將各種影響因素設(shè)置梯度，并進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)各個(gè)相關(guān)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以建立較為完善的反應(yīng)體系和程序。

1.3.4 RAPD產(chǎn)物檢測(cè) 取5μl擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行檢測(cè)。凝膠成像分析系統(tǒng)照相保存數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。

1.3.5 引物的篩選 將所選擇的樣品提取的DNA等量的混合，作為篩選引物的 DNA為模板。并對(duì)購(gòu)買的100個(gè)隨機(jī)引物分別進(jìn)行相同條件的RAPD擴(kuò)增，初步篩選出若干個(gè)多態(tài)性引物。再經(jīng)過二次篩選，選取擴(kuò)增DNA條帶型清晰、差異性和多態(tài)性好的引物。最后確定出最佳的隨機(jī)擴(kuò)增引物。

2 結(jié)果

2.1 基因組DNA提取質(zhì)量的檢測(cè)

本試驗(yàn)使用試劑盒提取玉米基因組DNA，以1%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 玉米基因組電泳檢測(cè)結(jié)果

從圖中可以看出，主帶清晰，無拖帶現(xiàn)象，間亮度均一，一般每克材料提取DNA產(chǎn)量在30～40μg之間。說明提取基因組DNA質(zhì)量好，產(chǎn)率高，完全滿足RAPD反應(yīng)體系的要求。

2.2 引物的篩選

通過實(shí)驗(yàn)從100個(gè)隨機(jī)引物中，篩出22個(gè)擴(kuò)增條帶清晰，多態(tài)性好的引物。圖2為部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2 玉米R(shí)APD部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 RAPD反應(yīng)體系

通過實(shí)驗(yàn)對(duì)影響RAPD擴(kuò)增結(jié)果的因子進(jìn)行研究篩選，并對(duì)其影響因素進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出了最合適玉米的RAPD條件，并利用該體系對(duì)所選的材料進(jìn)行擴(kuò)增，得到了清晰、多態(tài)性高的譜帶，具有較好的重復(fù)性，說明該體系穩(wěn)定可靠，適合于玉米的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 李明芳，鄭學(xué)勤.荔枝SSR標(biāo)記的研究.遺傳，2004，26（6）：

911-916.

[2] 洪丹丹，王正加，黃堅(jiān)欽.山核桃SSR反應(yīng)體系優(yōu)化.西南林學(xué)院學(xué)報(bào)，27，1：51-54.

[3] 代漢萍，雷家軍，鄧明琴.長(zhǎng)白山野生草莓資源的調(diào)查與分類研究.園藝學(xué)報(bào)，2007，34（1）：63-66.

[4] 王志剛，張志宏，李賀，等.利用RAPD和SCAR標(biāo)記鑒定草莓品種.園藝學(xué)報(bào)，2007，34（3）：591-596.

作者簡(jiǎn)介：李樹國(guó)（1956-），男，吉林農(nóng)業(yè)工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院教授，研究方向：糧食學(xué)與生物化學(xué)。