慢性乙型肝炎患者血清HBV RNA水平與核苷（酸）類似物治療時間的關(guān)系

范雪莉，詹愛琴，安 軼，田麗艷

1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000

2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院感染科，新疆 石河子 832000

3 中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，沈陽 110001

慢性乙型肝炎（CHB）是由HBV 入侵人體所引起的一類以肝臟慢性炎癥為主并可導(dǎo)致多種肝臟相關(guān)并發(fā)癥的一種傳染性疾?。?-2］。目前長期核苷（酸）類似物（NAs）治療是抗HBV 治療的主要方案［1］。CHB 患者治愈的金標(biāo)準(zhǔn)是清除肝組織中的共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）［3］，然而NAs 是通過持續(xù)的病毒學(xué)抑制來減少肝臟相關(guān)結(jié)局K 的風(fēng)險，無法徹底清除肝細胞核內(nèi)的cccDNA［4-5］，因此，即使檢測不到HBsAg 的存在，達到“功能性治愈”的標(biāo)準(zhǔn)，一旦停藥，仍有HBV 再激活的風(fēng)險［1］，這也是CHB 患者肝炎遷延不愈的原因所在。所以，在CHB 患者的治療過程中，準(zhǔn)確評估感染肝細胞中cccDNA 的轉(zhuǎn)錄活性，對于如何以及何時調(diào)整CHB 患者的治療方案具有重要作用。肝細胞中cccDNA 的檢測因其有創(chuàng)性而難以普及［6］，傳統(tǒng)的HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 檢測可以在一定程度上反映cccDNA 的狀態(tài)，是目前乙型肝炎患者診斷與療效判斷的主要指標(biāo)，而近年來的多項研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)病毒的逆轉(zhuǎn)錄、DNA 復(fù)制水平受到抑制時，患者血清中的乙型肝炎前基因組RNA（pgRNA）水平可以與傳統(tǒng)檢測指標(biāo)的結(jié)果相互補充反映患者體內(nèi)的病毒水平［7］。HBV pgRNA 是cccDNA 的直接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，2015 年之后陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)血清中所發(fā)現(xiàn)的HBV RNA 是存在于病毒樣衣殼內(nèi)，由細胞核中未逆轉(zhuǎn)錄成HBV DNA 的pgRNA 被病毒外包膜包裹后從被感染的肝細胞內(nèi)釋放至患者的外周血中。pgRNA 由cccDNA 直接轉(zhuǎn)錄而來，且不受NAs 作用機制的影響，因此被認(rèn)為是肝細胞內(nèi)HBV復(fù)制和治療反應(yīng)的新型生物標(biāo)志物，能作為客觀評價抗病毒療效及判定合適的停藥時機的反應(yīng)預(yù)測標(biāo)記［8-15］。本研究通過檢測臨床確診的CHB 患者的血清HBV RNA 水平，分析其與NAs 抗病毒治療時間及HBV DNA、HBsAg 的關(guān)系，為臨床判斷CHB 患者抗病毒療效提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2022年2月—2022年7 月就診于石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的300 例CHB 患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）CHB 診斷符合我國《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［1］中的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）具有完整的病史資料；（3）年齡＞18歲，無性別限制，均為漢族。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并有其他病毒性肝炎或人類免疫缺陷病毒感染者；（2）自身免疫性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝病或其他原因?qū)е碌膰?yán)重肝損傷者；（3）合并有肝癌或其他系統(tǒng)惡性腫瘤患者；（4）妊娠或兒童；（5）伴有嚴(yán)重心、肺、腎等臟器損害者。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患者的病史資料，包括性別、年齡，血清HBV RNA、HBV DNA、HBsAg、HBeAg、ALT、AST、抗病毒藥物及治療時間等。

1.2.2 血清HBV RNA水平檢測 采集患者靜脈血5 mL，-20 ℃保存，采用同步擴增檢測方法，使用HBV SAT檢測試劑盒（上海仁度生物科技有限公司），按照核酸檢測試劑盒使用說明書進行檢測。檢測分為核酸捕獲和實時熒光核酸恒溫擴增檢測兩部分，其中提取、擴增、檢測及樣本最終RNA 結(jié)果計算全部由AutoSAT 全自動核酸檢測系統(tǒng)自動完成。該試劑盒最低檢測下限為100拷貝/mL，檢測范圍102～108拷貝/mL，＞108拷貝/mL高于檢測上限。

1.2.3 血清HBV DNA、HBsAg、HBeAg、ALT、AST 水平檢測 分別采用相應(yīng)試劑盒或程序進行檢測，由本院醫(yī)學(xué)實驗室專職檢測人員完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用軟件SPSS 26.0 及GraphPad Prism 8 對數(shù)據(jù)進行分析處理。計量資料以M（P25～P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，進一步兩兩比較采用Bonferroni 校正法；計數(shù)資料組間比較用χ2檢驗。采用Spearman 相關(guān)分析比較各指標(biāo)間相關(guān)程度。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 300 例CHB 患者中HBeAg 陽性55 例（18.3%），HBeAg陰性245例（81.7%）。HBeAg陽性組與HBeAg 陰性組患者的年齡及血清HBV RNA、HBV DNA、HBsAg、ALT、AST 水平分布差異均有統(tǒng)計意義（P值均＜0.05）（表1）。

表1 一般資料比較Table 1 Comparison of general data

2.2 不同的抗病毒藥物對各指標(biāo)的影響 經(jīng)治患者共227 例，其中使用恩替卡韋抗病毒治療者180 例，使用替諾福韋者46例，聯(lián)合使用恩替卡韋及替諾福韋抗病毒治療者1 例，不同治療藥物的HBV DNA、HBV RNA 檢出率與HBV DNA、HBV RNA、HBsAg 水平分布情況均無統(tǒng)計學(xué)意義（P值均＞0.05）（表2）。

表2 不同的抗病毒藥物對各指標(biāo)的影響Table 2 Effects of different antiviral drugs on various indicators

2.3 抗病毒治療時間不同分組各指標(biāo)差異及相關(guān)性未治療組、治療時間≤1 年組、治療時間＞1 年組間HBV RNA、HBV DNA、HBsAg水平分布均具有統(tǒng)計學(xué)差異（P值均＜0.05），進一步兩兩比較，其中未治療組與治療時間≤1 年組僅有DNA 水平分布情況有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）；未治療組與治療時間＞1 年組HBV RNA、HBV DNA 水平分布有統(tǒng)計學(xué)差異（P值均＜0.05）；治療時間≤1年與治療時間＞1 年組中HBV RNA、HBV DNA、HBsAg 水平分布情況均有統(tǒng)計學(xué)差異（P值均＜0.05）（表3）。相關(guān)性分析顯示，抗病毒治療時間與HBV RNA、HBsAg水平呈極弱負相關(guān)（r值分別為-0.247、-0.138，P值均＜0.05），與HBV DNA水平呈強負相關(guān)（r=-0.771，P＜0.001）。

表3 抗病毒治療時間不同HBV RNA、HBV DNA、HBsAg水平差異Table 3 Differences in HBV RNA，HBV DNA，and HBsAg levels at different times of antiviral treatment

2.4 血清HBV RNA 與HBV DNA、HBsAg 水平的相關(guān)性血清HBV RNA 與HBV DNA、HBsAg 水平呈低度相關(guān)（r值分別為0.360、0.442，P值均＜0.001）（圖1）；進一步分層分析，在未治療組中，HBV RNA 與HBV DNA 水平呈強正相關(guān)（r=0.752，P＜0.001），與HBsAg 水平呈中度正相關(guān)（r=0.559，P＜0.001）；在治療時間≤1 年組中，HBV RNA 與HBV DNA、HBsAg 水平呈低度正相關(guān)（r值分別為0.396、0.388，P值均＜0.001）；在治療時間＞1 年組中，HBV RNA 與HBsAg 水平呈低度正相關(guān)（r=0.352，P＜0.001），與HBV DNA水平無相關(guān)性（P=0.253）。

圖1 HBV RNA與HBV DNA、HBsAg的相關(guān)性Figure 1 Correlation of HBV RNA with HBV DNA and HBsAg

2.5 經(jīng)治患者抗病毒的應(yīng)答情況與血清HBV RNA 的關(guān)系 血清HBV DNA 陽性者共105 例，HBV DNA 陰性者共195 例，在HBV DNA 陰性者中HBV RNA 陽性者占比44.1%（86/195）。而在經(jīng)治患者中，HBV DNA 陰性者195 例，HBV DNA 陽性者32 例，其中，治療時間≤1 年的患者，在HBV DNA 陰性者中HBV RNA 陽性者占比55.6%（35/63）；治療時間＞1年的患者，在HBV DNA陰性者中HBV RNA 陽性者占比38.6%（51/132），兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.952，P=0.026）。

3 討論

CHB 患者需要長期治療且反復(fù)發(fā)作的根本原因是肝細胞中的cccDNA 難以被完全清除［16-17］，這是患者體內(nèi)所有病毒RNA 來源的初始模板。HBsAg 在CHB 患者的治療過程中可以用來提示cccDNA 的活性，但是因為cccDNA 與整合的HBV 基因組皆是HBsAg 的來源，所以缺乏足夠的準(zhǔn)確性。而pgRNA理論上僅來源于cccDNA，其未啟動逆轉(zhuǎn)錄過程，被病毒外包膜包裹后以病毒顆粒的形式被釋放至血清中，因此目前有研究認(rèn)為pgRNA 是較傳統(tǒng)的病毒學(xué)檢測指標(biāo)能更好地反映cccDNA 轉(zhuǎn)錄活性的潛在臨床標(biāo)志物，可以用于監(jiān)測目前抗病毒治療的反應(yīng)［8，18-19］。而魯鳳民等［10］也提出應(yīng)將血清HBV RNA 和HBV DNA 水平皆低于檢測下限作為新的病毒學(xué)應(yīng)答標(biāo)準(zhǔn)。本研究分析發(fā)現(xiàn)，使用不同的NAs 治療對于血清HBV RNA、HBV DNA的檢出率及HBV RNA、HBV DNA載量和HBsAg 的濃度沒有明顯的影響，提示不同NAs 的療效相似。而HBeAg 陽性組年齡小于HBeAg 陰性組，這與彭亞夢等［20］的研究結(jié)果相似，提示HBeAg陰轉(zhuǎn)與年齡有關(guān)。同時HBeAg 陽性組中患者血清HBV RNA、HBV DNA、HBsAg水平皆顯著高于HBeAg陰性組，提示HBeAg陽性患者cccDNA轉(zhuǎn)錄活性高于HBeAg陰性患者。

本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清HBV RNA 與HBV DNA、HBsAg 水平呈低度相關(guān)（HBV DNA：r=0.360，HBsAg：r=0.442，P值均＜0.001），根據(jù)患者抗病毒治療時間不同將患者分為3組，分層分析顯示HBV RNA與HBV DNA、HBsAg 水平的相關(guān)性隨著治療時間的延長逐漸下降，這與王成康等［21］的研究結(jié)果相同。雖然血清HBV RNA 水平變化與抗病毒治療時間僅呈極弱負相關(guān)（r=-0.247，P＜0.05），但是血清HBV RNA 與HBV DNA 水平變化趨勢一致，比較發(fā)現(xiàn)未治療組HBV RNA、HBV DNA水平顯著高于治療時間＞1 年組、治療時間≤1 年組HBV RNA、HBV DNA 水平顯著高于治療時間＞1 年組，雖然未治療組與治療時間≤1年組HBV RNA 水平分布情況無明顯差異，但總體來看抗病毒治療的療程越長，HBV RNA、HBV DNA 水平越低，與其他學(xué)者［22-23］的研究結(jié)果相似，不同結(jié)果可能與患者個體差異有關(guān)。而在HBV DNA 陰性患者中，仍有40.4%的患者外周血中可以檢測到HBV RNA存在，與其他研究［24］結(jié)果一致，且HBV RNA陽性者在HBV DNA 陰性者中的占比隨著治療時間的延長而明顯降低，研究［8］表明HBV RNA 下降水平與HBV DNA 下降水平并不一致，HBV RNA 水平下降遠慢于HBV DNA水平，這提示當(dāng)患者出現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答后，可以根據(jù)患者HBV RNA 水平評估抗病毒療效及cccDNA 的活性。而HBsAg 水平并不完全遵循這一規(guī)律，這在一定程度上反映了HBsAg 水平不能準(zhǔn)確地反映CHB 患者體內(nèi)病毒復(fù)制情況。

綜上所述，血清HBV RNA水平或許可以與HBV DNA、HBsAg 水平等指標(biāo)共同監(jiān)測CHB 患者抗病毒治療的效果，尤其在未治療患者中反映病毒復(fù)制水平方面的準(zhǔn)確性較高，在HBV DNA 水平低于檢測下限時可以彌補無法快速、準(zhǔn)確檢測病毒學(xué)水平的空缺。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2023 年1 月28 日經(jīng)由石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號為KJX2022-074-01。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：范雪莉負責(zé)收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫論文，擬定寫作思路及修改論文；詹愛琴參與修改論文及最后定稿；安軼、田麗艷負責(zé)收集數(shù)據(jù)，資料分析。