花生肽的膜分離制備及抗氧化活性研究

摘 要：熱軋花生粕經(jīng)過(guò)雙菌種混菌固態(tài)發(fā)酵，將發(fā)酵產(chǎn)物溶解后經(jīng)過(guò)膜分離得到1 ku以下、1～3 ku、3～10 ku、10 ku以上四種分子量范圍的發(fā)酵濾過(guò)液。對(duì)四種分子量范圍的濾過(guò)液分別以不同的濃度進(jìn)行羥自由基清除、DPPH自由基清除、還原力、鐵離子螯合力試驗(yàn)，并以還原型谷胱甘肽作比較，發(fā)現(xiàn)3～10 ku分子量范圍的濾過(guò)液具有最高的抗氧化活性，其次為10 ku以上的濾過(guò)液，然后是1～3 ku的濾過(guò)液，1 ku以下的濾過(guò)液抗氧化活性最低。

關(guān)鍵詞：濾過(guò)液；抗氧化；膜分離

中圖分類號(hào)：S565.2；Q516 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）12-0032-04

Membrane Preparation of Peanut Peptides and Research

on Their Antioxidant Activity

Liu HongDui1， Gao JunAn2， Wei MingXiu1

（1.Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China；

2.Shandong Shijichun Foodstuff Co.， Ltd.， Linyi 276400， China）

Abstract Through the solid-stated fermentation of hot-rolled peanut meal with double strains of Aspergillus oryzae and Aspergillus niger， four molecular weight distributions （MWD） as <1 ku， 1～3 ku， 3～10 ku and >10 ku were obtained after dissolved in water and via membrane separation. Then the tests on hydroxyl radical-scavenging， DPPH radical-scavenging， reducing power and ferrous ion-chelating were carried out with GSH as check. The results showed that the 3～10 ku peptides had the highest antioxidant activity， then the peptides with the MWD >10 ku and in 1～3 ku. The peptides <1 ku had the lowest antioxidant activity.

Key words Filtrate； Antioxidant； Via membrane separation

花生是世界上重要的油料作物，花生經(jīng)過(guò)熱軋?zhí)幚砗蟮奈镔|(zhì)稱為熱軋花生粕。熱軋花生粕的蛋白質(zhì)含量豐富，含有人體必需的8種氨基酸。但目前花生粕一般作為飼料處理，利用價(jià)值低。將花生粕發(fā)酵可以獲得小分子量的多肽，小分子量的多肽具有抗氧化活性，能夠清除自由基，延緩衰老，具有很重要的價(jià)值。

膜分離[1]是以選擇性透過(guò)膜為分離介質(zhì)，在膜兩側(cè)施加推動(dòng)力（如壓力），使得原料側(cè)的組分選擇性地透過(guò)膜，從而達(dá)到濃縮分離的目的。膜分離具有操作簡(jiǎn)單、能耗低、無(wú)污染的優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于發(fā)酵產(chǎn)物的分離，可以將不同分子量的多肽分開。

本試驗(yàn)將微生物發(fā)酵后的多肽液用于抗氧化活性的研究，并用谷胱甘肽作為參照，發(fā)現(xiàn)其具有較高的抗氧化活性。

1 材料與方法

11 試驗(yàn)材料

熱軋花生粕購(gòu)自贛榆縣連香花生油廠，麩皮購(gòu)自市場(chǎng)，米曲霉（ACCC30789）、黑曲霉（ACCC30787）購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

菲洛嗪（ferrozine）、1，1-二苯基苦味苯肼（DPPH）均為色譜純，購(gòu)自Sigma公司。三氯乙酸、L-Glutathione（Reduced）、水楊酸、鐵氰化鉀、氯化亞鐵、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

12 儀器設(shè)備

紫外/可見分光光度計(jì)（Uitrospace 2100pro）：Biochrom有限公司。實(shí)驗(yàn)室用膜分離設(shè)備：上海魔速科學(xué)器材有限公司。雙功能水浴恒溫振蕩器：江蘇金壇市杰瑞爾電器有限公司。氣浴恒溫振蕩器：金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

13 試驗(yàn)方法

131 發(fā)酵產(chǎn)物的制備 熱軋花生粕18 g+麩皮2 g，含水量55%，裝入250 ml廣口瓶中滅菌備用。然后向其中接入搖床30℃培養(yǎng)48 h的米曲霉和黑曲霉菌體各4 ml，攪拌均勻后放入30℃恒溫培養(yǎng)箱中，每隔12 h攪拌一次，發(fā)酵96 h后停止。將發(fā)酵產(chǎn)物溶于200 ml蒸餾水中，100℃滅菌5 min，冷卻后4 000 r/min離心10 min，然后將沉淀重溶于200 ml蒸餾水，離心。重復(fù)3次，合并上清，備用。

132 超濾膜分離 將離心后的發(fā)酵上清液依次過(guò)10、5、3、1 ku的超濾膜，分別截留分子量范圍為10 ku以上、5～10、3～5、1～3、1 ku以下的濾過(guò)液，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

133 羥自由基清除試驗(yàn)[2] 向一支10 ml具塞試管中分別加入（6 mmol/L）H2O2、（6 mmol/L）FeSO4各2 ml，一定濃度的發(fā)酵多肽溶液2 ml，混勻，靜置10 min后向試管中加入（6 mmol/L）水楊酸-乙醇溶液2 ml，混勻后靜置30 min，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)510 nm下測(cè)定吸光值為A1；空白和對(duì)照分別用2 ml蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液和一定濃度的發(fā)酵多肽溶液，測(cè)定值分別為A2、A3（用蒸餾水調(diào)“0”點(diǎn)）。羥自由基清除率公式為：

清除率=1-A1-A2A3×100%

134 二苯代苦味苯肼（DPPH）自由基的清除試驗(yàn)[3] 向一支10 ml具塞試管中分別加入2 ml一定濃度的發(fā)酵多肽溶液和2 ml DPPH-95%乙醇溶液混勻，25℃水浴反應(yīng)30 min，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)517 nm下測(cè)定吸光值為A1；空白用2 ml蒸餾水代替一定濃度的發(fā)酵多肽溶液，對(duì)照用2 ml 95%乙醇代替DPPH-95%乙醇溶液，測(cè)定值分別為A2、A3（用蒸餾水調(diào)“0”點(diǎn)）。DPPH自由基清除率公式為：

清除率=1-A1-A2A3×100%

135 還原力試驗(yàn)[4] 1 ml一定濃度的發(fā)酵多肽溶液或蒸餾水，加入01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 66）和1%鐵氰化鉀各25 ml，混勻。50℃保溫20 min，立即冷卻，加入25 ml 10%TCA，混勻。3 000 r/min離心10 min，取上清25 ml加入25 ml H2O和01% FeCl3 05 ml，混勻，靜置10 min，在波長(zhǎng)700 nm測(cè)定吸光值。吸光值越大表示還原力越大。

136 亞鐵離子螯合[5] 樣品1 ml或水1 ml，加入27 ml水，再加入01 ml FeCl2，混勻后加入02 ml菲洛嗪，混勻后靜置10 min，562 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值分別為A1、A2。亞鐵離子螯合作用測(cè)定公式：

亞鐵離子螯合率=（1-A1A2）×100%

2 結(jié)果與分析

21 羥自由基的清除

羥自由基是已知最強(qiáng)的氧化劑，壽命極短，幾乎可以和細(xì)胞內(nèi)的所有成分發(fā)生反應(yīng)，造成生物體損傷，導(dǎo)致衰老和疾病。Fenton反應(yīng)是體內(nèi)產(chǎn)生羥自由基的主要反應(yīng)，用比色法測(cè)定Fenton反應(yīng)中產(chǎn)生的羥自由基，再向其中加入羥自由基清除劑多肽，則羥自由基減少，二價(jià)鐵離子增多，可以通過(guò)其與水楊酸-乙醇反應(yīng)的顏色變化，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值來(lái)確定對(duì)羥自由基的清除。

由圖1可以看出，在低濃度時(shí)，羥自由基的清除率都不高，在一定范圍內(nèi)，隨著多肽濃度的增加，羥自由基的清除率逐漸升高。其中谷胱甘肽的羥自由基清除率最高， 3～10 ku分子量范圍的濾過(guò)液的清除率與之最接近，其次為1～3 ku分子量范圍的濾過(guò)液，1 ku以下分子量范圍的濾過(guò)液清除率最低。說(shuō)明3～10 ku分子量范圍的濾過(guò)液羥自由基清除率最高，在濃度為2 mg/ml時(shí)清除率達(dá)到79%以上。

22 DPPH自由基的清除試驗(yàn)

二苯代苦味苯肼（DPPH）是一種很穩(wěn)定的自由基，DPPH-乙醇溶液為深紫色，溶液中DPPH自由基在517 nm波長(zhǎng)附近有強(qiáng)吸收，當(dāng)加入一定濃度的發(fā)酵多肽溶液時(shí)，吸收就會(huì)減弱或消失，因此可以通過(guò)測(cè)定517 nm處的吸光值變化來(lái)判斷對(duì)DPPH自由基的清除率[6]。

由圖2可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著多肽濃度的增加，DPPH自由基的清除率逐漸增加。其中3～10 ku的過(guò)濾液和10 ku以上的過(guò)濾液具有很高的DPPH自由基清除活性，但都略低于谷胱

自由基的清除率

甘肽；3～10 ku的濾過(guò)液變化幅度較大；10 ku以上的濾過(guò)液在低濃度時(shí)的清除率就比較高，可能由于含有很多美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物；高濃度時(shí)，3～10 ku的濾過(guò)液清除率較高，當(dāng)濃度為2 mg/ml時(shí)DPPH清除率達(dá)到945%；清除率最低的是1 ku以下的濾過(guò)液，1～3 ku的濾過(guò)液次之。

23 還原力試驗(yàn)

由圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，700 nm下的吸光值逐漸增加，還原力逐漸增大。其中3～10 ku的濾過(guò)液在700 nm波長(zhǎng)下的吸光值大于其他三種濾過(guò)液，小于谷胱甘肽的吸光值，說(shuō)明3～10 ku的濾過(guò)液還原力高于其他組分，低于谷胱甘肽。10 ku以上的濾過(guò)液吸光值略高于1～3 ku的濾過(guò)液，1 ku以下的濾過(guò)液吸光值幾乎為零，說(shuō)明還原力最低。另外，吸光值大的組分變化也較快。

24 鐵離子螯合

二價(jià)鐵離子是誘發(fā)多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的催化劑，菲洛嗪能夠與Fe2+結(jié)合形成紫色復(fù)合物，在562 nm波長(zhǎng)下具有強(qiáng)吸收，如果向反應(yīng)體系中加入鐵離子螯合劑，反應(yīng)體系中的復(fù)合物就會(huì)減少，從而使吸光值減小，吸光值越小表明多肽與亞鐵離子的螯合率越高。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著多肽濃度的增加，亞鐵離子的螯合率逐漸升高，其中10 ku以上分子量的濾過(guò)液螯合率最高，1 ku以下濾過(guò)液也具有較高的螯合率。1～3 ku濾過(guò)液的螯合率較低，3～10 ku分子量的濾過(guò)液隨著濃度的增加，螯合率增加緩慢（圖4）。谷胱甘肽與亞鐵離子的螯合率極低，在此濃度范圍內(nèi)幾乎為零。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵濾過(guò)液具有較高的抗氧化活性，并且比冷軋花生粕分解后的多肽抗氧化活性高[7]，其中3～10 ku膜分離組分抗氧化活性最好，對(duì)DPPH自由基的清除率最高，在濃度為2 mg/ml時(shí)清除率達(dá)到945%；同時(shí)對(duì)羥自由基也有很好的清除率，在濃度為2 mg/ml時(shí)清除率達(dá)到7901%；在濃度為2 mg/ml時(shí)與亞鐵離子的螯合率達(dá)到5286%，并且具有一定的還原力。

10 ku以下分子量范圍的多肽具有較高的抗氧化活性，但是10 ku以上分子量范圍多肽液也具有較高的抗氧化活性，尤其是在低濃度時(shí)10 ku以上分子量范圍的抗氧化活性相對(duì)較高?？赡苁且?yàn)楦邷卣ビ瓦^(guò)程中，高溫促使花生粕中的蛋白和糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生很多大分子褐變色素，因此10 ku以上的濾過(guò)液呈現(xiàn)褐色，3～10 ku分子量范圍的濾過(guò)液在高濃度時(shí)也有一定的褐色，低于3 ku分子量的不呈現(xiàn)褐色。并且美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的非揮發(fā)性成分具有螯合金屬離子的特性[8]，因此10 ku以上的濾過(guò)液鐵離子螯合率最高。參 考 文 獻(xiàn)：

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