三個新的大白菜CBL基因的鑒定和特征分析

摘 要：利用大白菜已知CBL基因序列，在公共核酸數(shù)據(jù)庫中重新搜索比對大白菜的基因組序列，鑒定出3個新的大白菜CBL基因，并對這3個基因的結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化和順式元件進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步克隆和研究這些基因的功能提供了有益借鑒。

關(guān)鍵詞：大白菜；CBL基因；基因結(jié)構(gòu)；遺傳進(jìn)化；順式元件

中圖分類號：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0007-04

Identification and Characteristics Analysis of Three Novel

CBL Genes from Chinese Cabbage

Zhang YongTao1， Liu LiFeng2， Li HuaYin2， Zhang YiHui2， Wang HuanQin3，

Wang FengDe2， Gao JianWei2， Li LiBin2*

（1.Institute of Vegetables， Linyi Academy of Agricultural Sciences， Linyi 276012， China；

2.Institute of Vegetables， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Key Laboratory for Biology of

Greenhouse Vegetables/Shandong Branch of National Vegetable Improvement Center， Jinan 250100， China；

3.Leling Agricultural Bureau， Leling 253600， China）

Abstract Three novel CBL genes were indentified from Chinese cabbage by using the known CBL genes of Chinese cabbage as queries to blast the Chinese genome sequences in public nuclear acid databases. The structure， phylogeny and cis-elements of these genes were analyzed. This study provided valuable information for further cloning and functional analysis of these novel CBL genes.

Key words Chinese cabbage； CBL genes； Gene structure； Phylogeny；Cis-elements

近年來研究表明，植物中一類與鈣結(jié)合的蛋白（類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白，Calcineurin-B like protein）基因CBL家族在植物應(yīng)答干旱、鹽堿、低溫脅迫、礦質(zhì)營養(yǎng)吸收、ABA以及鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中具有重要功能[2，5，10，13，15，17]，CBL蛋白主要是作為鈣感受器與一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（CIPK）互作來調(diào)控下游基因的表達(dá)，以響應(yīng)各種不同的逆境和激素信號[2，4]。例如，在擬南芥中CBL4（SOS3）和CBL10蛋白可以和CIPK24（SOS2）結(jié)合，調(diào)控下游基因SOS1（鈉離子/質(zhì)子-反向運輸?shù)妮d體）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞中鈉離子的排出，從而提高植物對鹽脅迫的抗性[2，11，16]。又如，在擬南芥中CBL1和CBL9與CIPK23結(jié)合，調(diào)控下游基因AKT1的表達(dá)，從而促進(jìn)鉀離子的吸收[7，17]。另外，AtCBL2和CIPK11結(jié)合可以調(diào)控擬南芥對堿（高pH）的抗性[8]；擬南芥AtCBL1、2、3、5、10基因在干旱、鹽脅迫和ABA信號應(yīng)答過程中具有重要功能[4，9，12，14，16]。在水稻、玉米等農(nóng)作物中也有研究[3，8，9，11]，但在我國重要蔬菜作物中缺乏系統(tǒng)研究。在以往的研究中，本文作者通過生物信息學(xué)分析，從大白菜基因組中鑒定出13個CBL基因，并對它們的遺傳進(jìn)化進(jìn)行了分析[1]。在此基礎(chǔ)上，作者利用大白菜已知CBL基因序列，在公共核酸數(shù)據(jù)庫中重新搜索比對大白菜的基因組序列，鑒定出3個新的大白菜CBL基因，并對這3個基因的結(jié)構(gòu)、遺傳進(jìn)化和順式元件進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步克隆和研究這些基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 研究方法

利用大白菜已知CBL基因序列在GenBank中重新搜索比對大白菜的基因組序列 （http：//blastncbinlmnihgov/Blastcgi），尋找新的大白菜CBL基因序列，對鑒定出的CBL新基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析和遺傳進(jìn)化分析，并對它們啟動子序列中的順式元件進(jìn)行預(yù)測。結(jié)構(gòu)分析利用GSDS（http：//gsdscbipkueducn/）在線進(jìn)行，遺傳進(jìn)化分析利用MEGA41進(jìn)行，采用Bootstrap test-Neighbor Joining 方法，重復(fù)500次運算，順式元件預(yù)測采用PlantCARE軟件進(jìn)行在線分析。亞細(xì)胞定位預(yù)測在WoLF PSORT （http：//wolfpsortorg/） 中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

21 大白菜3個新CBL基因的鑒定和結(jié)構(gòu)特征分析

利用已知的大白菜CBL基因序列，在GenBank中重新搜索和比對，發(fā)現(xiàn)了3個新的大白菜CBL基因，分別位于大白菜A01和A10染色體上的BAC AC2347501、CU6953051和FP325321中，它們在大白菜基因組數(shù)據(jù)庫BRAD中對應(yīng)的基因位點分別為Bra002301、Bra026421和Bra011404。在BRAD中，Bra002301解析的編碼區(qū)為333 bp，不僅與我們的結(jié)果大不相同，與擬南芥等物種中的CBL編碼區(qū)大小也相差甚遠(yuǎn)。據(jù)此認(rèn)為，Bra002301的解析結(jié)果可能不正確， 而BRAD中Bra011404的解析結(jié)果與本文一致。Bra026421的編碼區(qū)為657 bp，與本文的解析結(jié)果相近。另外，本文還發(fā)現(xiàn)，CU6953051中的CBL基因可能存在可變剪切，預(yù)測編碼區(qū)大小還有822 bp和762 bp兩種形式。這3個新基因基因組序列中內(nèi)含子的數(shù)目分別為7和6，外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)如圖1所示。它們預(yù)測編碼的蛋白可能分別定位到細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中（見表1），顯示在功能上可能有所不同。

注：方框代表外顯子，線代表內(nèi)含子。

圖1 大白菜3個新CBL基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)

22 大白菜3個新CBL基因的進(jìn)化分析

這3個新的大白菜CBL基因與擬南芥和已知13個大白菜CBL基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系如圖2所示。AC2347501與AtCBL5直系同源；FP325321與BrCBL10關(guān)系最近，為姊妹對基因，并分別與AtCBL10直系同源；CU6953051與BrCBL3為姊妹對基因，和AtCBL2在一個類群中?，F(xiàn)有研究表明，AtCBL2在高pH抗性和ABA應(yīng)答中具有重要功能[7，17]，AtCBL5的過表達(dá)可以增強(qiáng)植物對干旱和滲透脅迫的抗性[18]，而AtCBL10在植物鹽脅迫應(yīng)答過程中具有重要功能[15]。因此，本文推測大白菜AC2347501在滲透脅迫應(yīng)答過程中具有一定功能，CU6953051可能參與高pH抗性和ABA應(yīng)答過程，而FP325321可能參與鹽脅迫應(yīng)答過程。23 大白菜新CBL基因的順式調(diào)控元件

為了研究大白菜新CBL基因的功能和表達(dá)模式，我們對其啟動子及其上游序列中的順式反應(yīng)元件進(jìn)行了分析和預(yù)測。結(jié)果表明，大白菜新CBL基因擁有多種逆境和激素應(yīng)答元件，且各不相同。這3個新基因都含有干旱應(yīng)答元件MBS和逆境與病原物應(yīng)答元件TC-rich 重復(fù)序列，而且只有FP325121含有脫落酸響應(yīng)元件ABRE、赤霉素響應(yīng)元件GARE、生長素應(yīng)答元件TGA、水楊酸應(yīng)答元件TCA和冷脅迫應(yīng)答元件LTR，沒有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA和熱脅迫應(yīng)答元件HSE，此外，它還有乙烯應(yīng)答元件ERE；CU6953051

圖2 大白菜與擬南芥CBL基因的進(jìn)化分析

含有的順式元件較少，除MBS和TC-rich序列外，還含有一個茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA；而AC2347501還有乙烯應(yīng)答元件ERE、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA、熱脅迫應(yīng)答元件HSE。這說明這3個基因在激素和逆境響應(yīng)過程中的功能有所不同，F(xiàn)P325321可響應(yīng)多種激素信號以及干旱、溫度和病原物脅迫，而CU6953051 可能響應(yīng)茉莉酸甲酯信號和干旱及病原物脅迫，AC2347501可響應(yīng)乙烯和茉莉酸甲酯信號以及熱脅迫、干旱脅迫及病原物脅迫。

3 結(jié)論

通過基因組數(shù)據(jù)深入挖掘，從大白菜基因組中鑒定出3個新的CBL基因，序列分析和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)這3個新基因確實與已知的13個大白菜CBL基因不同。至此，我們已發(fā)現(xiàn)在大白菜基因組中至少存在著16個CBL基因。順式調(diào)控元件分析顯示，這3個新的大白菜CBL基因的上游序列中含有的激素和逆境應(yīng)答元件各不相同，說明它們在功能上可能有所不同。根據(jù)遺傳進(jìn)化分析的結(jié)果和已知擬南芥相應(yīng)基因的功能，推測大白菜AC2347501在滲透脅迫應(yīng)答過程中具有一定功能，CU6953051可能參與高pH抗性和ABA應(yīng)答過程，而FP325321可能參與鹽脅迫應(yīng)答過程。至于它們實際功能如何，還需要實驗進(jìn)一步驗證。本文為進(jìn)一步克隆和研究這3個大白菜新的CBL基因的功能奠定了基礎(chǔ)。參 考 文 獻(xiàn)：

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