加拿大紅楓組織培養(yǎng)條件的優(yōu)化

摘要：以加拿大紅楓（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．）的頂芽和側(cè)芽為外植體，考察不同消毒劑處理時(shí)間對(duì)消毒效果的影響，以及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽增殖的影響。結(jié)果表明，外植體的最佳采集時(shí)期為４月中旬；先用體積分?jǐn)?shù)７０％的乙醇處理１５ ｓ，再用１ ｍｇ／ｍＬ ＨｇＣｌ２處理７ ｍｉｎ，最后用２０ ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌＯ浸泡２５ ｍｉｎ，加拿大紅楓外植體的消毒效果好，且存活率最高，為９０％。誘導(dǎo)加拿大紅楓愈傷組織的適宜培養(yǎng)基為１/２ ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３。較適合加拿大紅楓不定芽增殖的培養(yǎng)基為１/２ ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３。

關(guān)鍵詞：加拿大紅楓（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．）；愈傷組織；不定芽；誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：Ｓ７２３．１＋３２；Ｓ７９２．３５ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）17－3872-04

Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Cｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃａｎａｄｉａｎ Ｍａｐｌｅ

ＨＵ Ｘｕｅ－ｙａｎ１，ＨＵ Ｙｅ－ｈｕａ１，ＧＵＡＮ Ｑｉａｎ２，ＬＩＡＮ Ｆａｎｇ－ｑｉｎｇ２，ＣＨＥＮ Ｙｉ－ｆａｎｇ１

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｊｉａｎｇｘｉ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００１３，China；

２. College of Landscape and Art， Ｊｉａｎｇｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｃｈａｎｇ ３３００４６，China）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｂｕｄｓ ａｎｄ ｌａｔｅｒａｌ ｂｕｄｓ ｏｆ Ｃａｎａｄｉａｎ ｍａｐｌｅ（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．） ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ｏｎ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗａｓ ｉｎ ｍｉｄ－Ａｐｒｉｌ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｉｎ ７０％ ａｌｃｏｈｏｌ ｆｏｒ １５ ｓ， ｔｈｅｎ ｉｎ １ ｍｇ／ｍＬ ＨｇＣｌ２ ｆｏｒ ７ ｍｉｎ ａｎｄ ｉｎ ２０ ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌＯ ｆｏｒ ２５ ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｃａｌｌｕｓ ｗａｓ １/２ ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｗａｓ １/２ ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ｍｇ／Ｌ ＧＡ３．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｃａｎａｄｉａｎ ｍａｐｌｅ（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．）； ｃａｌｌｕｓ； ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｓｈｏｏｔｓ； ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ

加拿大紅楓（Ａｃｅｒ ｒｕｂｒｕｍ Ｌ．）別名紅花槭、北美紅楓、北方紅楓、美國(guó)紅楓、沼澤楓、紅糖槭、猩紅楓等，屬槭樹(shù)科槭樹(shù)屬，原產(chǎn)于北美洲，主要分布在加拿大和美國(guó)東北部的大部分地區(qū)。屬于大型喬木，樹(shù)形直立向上，樹(shù)冠圓形，整潔優(yōu)美，葉、花、果均有很高的觀賞價(jià)值［１］。其生長(zhǎng)速度快，適應(yīng)范圍廣，在園林綠化中被廣泛應(yīng)用［２］。加拿大紅楓在我國(guó)引種的時(shí)間不長(zhǎng)，繁殖方式也以播種、嫁接為主，但繁殖系數(shù)較低，而引種栽培價(jià)格又比較貴，嚴(yán)重影響了紅楓的規(guī)模發(fā)展與推廣［３，４］。組織培養(yǎng)技術(shù)具有效率高、生長(zhǎng)快、周期短、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［５］，關(guān)于加拿大紅楓的組織培養(yǎng)研究已有一定的報(bào)道。如王振龍等［６］曾以其種胚為材料誘導(dǎo)出愈傷組織并增殖；宗樹(shù)斌等［７］以實(shí)生苗葉片和嫩莖為外植體誘導(dǎo)出愈傷組織并增殖成功。本實(shí)驗(yàn)以加拿大紅楓枝芽為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，摸索適宜的外植體消毒方式、采集時(shí)期，優(yōu)化誘導(dǎo)愈傷組織及不定芽的培養(yǎng)基，以期為建立加拿大紅楓組培快繁技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 材料與儀器

外植體取自江西科技師范大學(xué)楓林校區(qū)花圃２００９年１２月底引種的加拿大紅楓１～２年生優(yōu)質(zhì)苗木。于２０１０年３～１０月苗木生長(zhǎng)季節(jié)，在晴朗的午后１４∶００～１５∶００采集生長(zhǎng)優(yōu)良無(wú)病蟲(chóng)害的枝芽（頂芽和側(cè)芽）為外植體。

主要儀器包括ＰＹＸ－３００Ｑ－Ａ人工氣候培養(yǎng)箱（韶關(guān)市科力實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、ＺＨＪＨ－１２１４Ｂ垂直流超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）、ＪＪ５００型精密電子天平（美國(guó)雙杰兄弟公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、立式高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ超純水系統(tǒng)（美國(guó)ＭｉｌｌｉＰｏｒｅ公司）等。

１．２ 實(shí)驗(yàn)方法

１．２．１ 外植體的預(yù)處理 選取加拿大紅楓枝芽為外植體，首先將取回的材料在１０％的洗衣粉水中浸泡３０ ｍｉｎ，用試管刷蘸洗衣粉水順著芽生長(zhǎng)的方向輕輕刷洗后用自來(lái)水沖洗干凈，剪成１．５～２．０ ｃｍ帶芽的小段，再在流水下沖洗４０ ｍｉｎ左右。

１．２．２ 外植體的消毒 外植體預(yù)處理后置于超凈工作臺(tái)上，枝芽先后用７０％的乙醇（體積分?jǐn)?shù)，下同）、１ ｍｇ／ｍＬ的ＨｇＣｌ２和２０ ｍｇ／ｍＬ的ＮａＣｌＯ浸泡處理，每次處理后用無(wú)菌水沖洗５～６次，處理過(guò)程中均需用鑷子攪動(dòng)或晃動(dòng)，以達(dá)到充分處理的目的，各處理不同消毒劑的具體處理時(shí)間見(jiàn)表１，將消毒處理后的外植體接種到１/２ＭＳ培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度（２５±２）℃、濕度６５％、光照時(shí)間１４ ｈ／ｄ、光照度１ ５００～２ ０００ ｌｘ［８］的條件下培養(yǎng)７ ｄ，統(tǒng)計(jì)各處理的污染率、死亡率、存活率。

污染率＝污染的外植體數(shù)／接種的外植體總數(shù)×１００％

死亡率＝褐化死亡的外植體數(shù)／接種的外植體總數(shù)×１００％

存活率＝１－污染率－死亡率

１．２．３ 外植體采樣時(shí)期對(duì)污染率的影響 分別于３月上旬、４、５、６、７和９月中旬采集莖段外植體，依次用７０％的乙醇處理１５ ｓ、１ ｍｇ／ｍＬ的ＨｇＣｌ２處理７ ｍｉｎ、２０ ｍｇ／ｍＬ的ＮａＣｌＯ浸泡處理２５ ｍｉｎ，每次處理后用無(wú)菌水沖洗５～６次，其他培養(yǎng)條件同１．２．２，觀察外植體采樣時(shí)期對(duì)其污染率的影響。

１．２．４ 愈傷組織的誘導(dǎo) 在無(wú)菌條件下切除外植體直接接觸消毒液的切口，保留芽部分。以１/２ＭＳ為基本培養(yǎng)基，將處理好的枝芽接種于添加了不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上，各生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度組合見(jiàn)表３，每處理接種數(shù)為２０瓶，每瓶１個(gè)外植體，３０ ｄ后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率［９］。

誘導(dǎo)率＝出愈外植體個(gè)數(shù)／接種的外植體總數(shù)×１００％

１．２．５ 不定芽的增殖 在無(wú)菌條件下將形成的愈傷組織切割為０．５～０．８ ｃｍ２大小的小塊，轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方與愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同，每個(gè)培養(yǎng)基接種１塊愈傷組織。４０ ｄ后觀察統(tǒng)計(jì)不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其配比對(duì)不定芽增殖的影響。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 消毒劑處理時(shí)間對(duì)外植體污染率的影響

各消毒劑的處理時(shí)間不同，外植體的污染率和死亡率也不同（表１）。由表１可以看出，隨著消毒劑處理時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體的污染率總體呈下降趨勢(shì)，但處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，死亡的外植體個(gè)數(shù)也增加，表明過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的處理會(huì)對(duì)外植體造成損傷。７０％的乙醇、１ ｍｇ／ｍＬ的ＨｇＣｌ２、２０ ｍｇ／ｍＬ的ＮａＣｌＯ處理時(shí)間分別為１５ ｓ、７ ｍｉｎ、２５ ｍｉｎ，外植體的污染率為１０％，死亡率為０，存活率最高，為９０％，是較適宜的外植體消毒處理時(shí)間。

２．２ 不同采集時(shí)期對(duì)外植體污染的影響

不同時(shí)期采集的外植體消毒后用于組織培養(yǎng)，污染率、死亡率和存活率結(jié)果見(jiàn)表２。由表２可以看出，３月上旬接種的外植體污染率最低，只有１０．０％，但其死亡率高達(dá)４０．０％，這可能是因?yàn)椴杉庵搀w時(shí)間較早，外植體尚未萌動(dòng)。４月中旬采集的外植體消毒效果最好，污染率和死亡率均較低，存活率高達(dá)６５．０％，此時(shí)植株開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛期，且新生枝莖暴露的時(shí)間較短，帶菌較少，因而消毒效果最好。隨著植物生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，５～９月采集的外植體存活率逐漸降低。外植體在自然狀態(tài)下暴露的時(shí)間越長(zhǎng)，帶菌量增多，導(dǎo)致污染率上升，同時(shí)植株開(kāi)始木質(zhì)化，樹(shù)芽逐漸進(jìn)入休眠狀態(tài)，組織培養(yǎng)的存活率也因此降低。

２．３ 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體接種９ ｄ后，個(gè)別枝芽切口部分變綠或側(cè)芽處產(chǎn)生愈傷組織，產(chǎn)生的愈傷組織會(huì)慢慢膨大，呈淺綠色或暗紅色的團(tuán)狀結(jié)構(gòu)（圖１）。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表３）可知，６－ＢＡ、２，４－Ｄ和ＮＡＡ均會(huì)對(duì)加拿大紅楓愈傷組織的誘導(dǎo)產(chǎn)生影響。在添加相同濃度的６－ＢＡ?xí)r，愈傷組織的誘導(dǎo)率隨著ＮＡＡ濃度的升高而降低，說(shuō)明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)低濃度的ＮＡＡ有利于愈傷組織的誘導(dǎo)。而ＮＡＡ濃度為０．１ ｍｇ／Ｌ時(shí)，培養(yǎng)基中添加２．０ ｍｇ／Ｌ的６－ＢＡ，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，其中４、１０、１１號(hào)處理中愈傷組織誘導(dǎo)率均為１００％。培養(yǎng)基中添加２，４－Ｄ較未添加時(shí)愈傷組織生長(zhǎng)狀況好，添加量為０．５ ｍｇ／Ｌ時(shí)愈傷組織較疏松，生長(zhǎng)快，顏色鮮艷。所以確定１/２ ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３為愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

２．４ 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

將愈傷組織轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，４０ ｄ后，１號(hào)處理中有４個(gè)不定芽發(fā)生，３號(hào)處理中誘導(dǎo)出了２個(gè)不定芽（圖２），其他的培養(yǎng)基中不見(jiàn)不定芽發(fā)生，初步判斷適宜誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基為１/２ ＭＳ＋１．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３。

３ 小結(jié)與討論

３．１ 外植體的消毒效果

在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體消毒是最初的也是極為重要的步驟。一般來(lái)說(shuō)，材料的消毒措施力度（消毒劑的殺菌力、使用濃度、消毒時(shí)間等）越強(qiáng)，滅菌就越徹底，污染率就越低，但是消毒劑對(duì)植物組織細(xì)胞具有一定的毒性，消毒力度過(guò)強(qiáng)會(huì)使細(xì)胞機(jī)能受損，從而降低成活率［１０－１２］。判斷某種消毒方法適合與否，要同時(shí)考察污染率和死亡率，以存活率為主要依據(jù)［１３］。

外植體的生理活性狀態(tài)和季節(jié)環(huán)境變化對(duì)其消毒效果亦有顯著的影響［１４］。春、夏季植物生長(zhǎng)旺盛、生命力強(qiáng)，且光照充足不利于雜菌滋生，采集的外植體帶菌量低，消毒效果好；而秋季植物體生理代謝緩慢、枝條木質(zhì)化程度高，采集的外植體通常帶菌量高，難以獲得理想的消毒效果。而且隨著加拿大紅楓生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，色素會(huì)不斷累積，從而導(dǎo)致接種的外植體容易發(fā)生褐變，因此秋季尤其不宜采集組培材料。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，在采用相同的消毒方式處理時(shí)，４月中旬采集的外植體存活率最高；而最佳的消毒方法為首先經(jīng)體積分?jǐn)?shù)７０％的乙醇消毒１５ ｓ，然后用１ ｍｇ／ｍＬ ＨｇＣｌ２溶液處理７ ｍｉｎ，再用２０ ｍｇ／ｍＬ ＮａＣｌＯ溶液消毒２５ ｍｉｎ。

３．２ 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的作用

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，改變生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度已成為提高愈傷組織誘導(dǎo)與分化效率的有效手段。目前已有許多關(guān)于利用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑提高愈傷組織誘導(dǎo)率的報(bào)道，但是在實(shí)驗(yàn)中，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類和濃度組合的效果差異較大，這主要是由于外植體本身所含有的激素水平存在差異，從而所需要的外源激素不同［１５］。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到的最佳生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ２，４－Ｄ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ＋０．１ ｍｇ／Ｌ ＧＡ３，其能夠使愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到１００％。

３．３ 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度配比對(duì)不定芽增殖的作用

轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中的愈傷組織只有２個(gè)處理誘導(dǎo)出了不定芽，無(wú)法最終確定生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及其濃度配比對(duì)不定芽增殖的影響，適宜的增殖培養(yǎng)基配方還有待于進(jìn)一步研究和優(yōu)化。

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