高粱ＳＳＲ標(biāo)記的篩選及ＰＣＲ反應(yīng)程序的優(yōu)化

摘要：以ＢＪ－２９９、Ｔｘ６２２Ｂ、Ｗ４５６、忻粱５２和Ｒｏｍａ ５個(gè)高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ］品種的基因組ＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ擴(kuò)增以篩選ＳＳＲ分子標(biāo)記引物。設(shè)計(jì)不同的退火溫度和擴(kuò)增程序，對(duì)２５０對(duì)ＳＳＲ引物進(jìn)行篩選和反應(yīng)程序的優(yōu)化。結(jié)果表明，２５０對(duì)ＳＳＲ引物中有２２３對(duì)引物擴(kuò)增成功，大部分引物的退火溫度為５５～５７ ℃，共篩選出１２５對(duì)在耐鹽堿品種ＢＪ－２９９與鹽堿敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ間表現(xiàn)出多態(tài)性的ＳＳＲ引物。

關(guān)鍵詞：高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ］；ＳＳＲ；ＰＣＲ；引物篩選

中圖分類號(hào)：Ｓ５１４；Ｑ９４３ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）17－3869-03

The Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ of ＳＳＲ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ

ＨＡＮ Ｙｕｎ，ＧＡＯ Ｊｉａｎ－ｍｉｎｇ，ＳＵＮ Ｓｈｏｕ－ｊｕｎ，ＰＥＩ Ｚｈｏｎｇ－ｙｏｕ，ＬＵＯ Ｆｅｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ， Ｔｉａｎｊｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｔｉａｎｊｉｎ ３００３８４， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ ５ Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ， ＢＪ－２９９， Ｔｘ６２２Ｂ， Ｗ４５６， Ｘｉｎｌｉａｎｇ ５２ ａｎｄ Ｒｏｍａ， ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ． Ｂｙ ａｄｊｕｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ， ２２３ ｏｕｔ ｏｆ ２５０ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ， ｏｆ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ was ｍｏｓｔｌｙ ５５～５７ ℃． １２５ ＳＳＲ ｍａｒｋｅｒｓ ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓａｌｉｎｅ ａｌｋａｌｉ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｖａｒｉｅｔｙ ＢＪ－２９９ ａｎｄ ｓａｌｉｎｅ ａｌｋａｌｉ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｖａｒｉｅｔｙ Ｔｘ６２２Ｂ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ； ＳＳＲ； ＰＣＲ； ｐｒｉｍｅｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ

近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組和遺傳育種等的研究，成為現(xiàn)代分子生物學(xué)和遺傳學(xué)發(fā)展的主流［１］。其中ＳＳＲ標(biāo)記技術(shù)具有易于操作、技術(shù)簡(jiǎn)便、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，目前在玉米、水稻、大豆和小麥等作物的遺傳連鎖圖譜構(gòu)建［２－５］、品種鑒定［６］、種子純度檢測(cè)［７］、基因定位［８－１１］、遺傳差異和多樣性研究［１２－１６］等方面得到了廣泛應(yīng)用。高粱［Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ （Ｌ．） Ｍｏｅｎｃｈ］是世界上第五大禾谷類作物［１７］，可作為糧食作物及動(dòng)物飼料。ＳＳＲ分子標(biāo)記在高粱的遺傳育種等研究中已有廣泛的應(yīng)用［１８，１９］。Ｌｉ等［２０］已經(jīng)在高粱１０條染色體上物理定位了１ ６９２個(gè)ＳＳＲ標(biāo)記；Ｍｅｎｚ等［２１］通過(guò)物理定位和遺傳定位在高粱的１０條染色體上定位了２０２個(gè)ＳＳＲ標(biāo)記，這些ＳＳＲ標(biāo)記為高粱的遺傳改良研究奠定了基礎(chǔ)。然而這些已報(bào)道的ＳＳＲ的ＰＣＲ反應(yīng)條件不一樣，因此有必要建立高效通用的ＳＳＲ反應(yīng)體系，以提高分析效率。本研究對(duì)高粱ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化并進(jìn)行了ＳＳＲ引物的篩選，以期為高粱種質(zhì)資源遺傳結(jié)構(gòu)分析和重要農(nóng)藝性狀的ＱＴＬ定位奠定基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

實(shí)驗(yàn)選用３個(gè)甜高粱品種Ｗ４５６、Ｒｏｍａ和ＢＪ－２９９（耐鹽堿品種）、１個(gè)粒用高粱品種忻粱５２及１個(gè)保持系Ｔｘ６２２Ｂ（鹽堿敏感品種），均由天津農(nóng)學(xué)院作物遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。２００９年將這些高粱種植于天津農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)田，在植株拔節(jié)期前后取各單株葉片，液氮速凍后保存于－８０ ℃超低溫冰箱中備用。

１．２ 實(shí)驗(yàn)方法

１．２．１ 基因組ＤＮＡ的提取 采用改良的ＣＴＡＢ法從高粱葉片中提取基因組ＤＮＡ［２２］，使用０．８％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提ＤＮＡ的數(shù)量與質(zhì)量，將濃度調(diào)整一致后于－２０ ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

１．２．２ ＳＳＲ引物的選擇 采用Ｐｒｅｍｉｅｒ ５軟件對(duì)已報(bào)道的ＳＳＲ引物的退火溫度等參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，首先保留退火溫度為５５～６５ ℃、ＧＣ含量為４０％～６０％和目標(biāo)片段長(zhǎng)度不小于１２０ ｂｐ的引物，然后在保證遺傳距離比較均勻的前提下，選擇等位基因數(shù)目多、其他參數(shù)較優(yōu)的引物，共挑選了２５０對(duì)引物用于本實(shí)驗(yàn)，其染色體分布及平均物理距離列于表１。引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成。ＰＣＲ反應(yīng)體系為１５ μＬ，包括５ ｎｇ／μＬ的ＤＮＡ模板４ μＬ、５ Ｕ／μＬ Ｔａｑ酶 ０．１ μＬ、１０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １．５ μＬ、０．７５ μｍｏｌ／Ｌ正反向引物各６ μＬ、１０ ｍｍｏｌ／μＬ ｄＮＴＰｓ ０．３ μＬ、超純水３．１ μＬ。

１．２．３ ＰＣＲ反應(yīng)程序的優(yōu)化 由于在進(jìn)行ＳＳＲ－ＰＣＲ擴(kuò)增時(shí)，退火溫度（Ｔｍ）和擴(kuò)增程序?qū)Y(jié)果有較大影響，本研究的優(yōu)化主要針對(duì)這兩個(gè)因素進(jìn)行。退火溫度設(shè)５５、５７、５９、６１ ℃ ４個(gè)梯度，具體根據(jù)已報(bào)道的引物退火溫度進(jìn)行設(shè)置?？偨Y(jié)已報(bào)道的ＰＣＲ反應(yīng)條件，設(shè)計(jì)了２個(gè)反應(yīng)程序：①９４ ℃預(yù)變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性１ ｍｉｎ，Ｔｍ退火３０ ｓ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)；７２℃延伸６ ｍｉｎ。②９４ ℃預(yù)變性４ ｍｉｎ；９４ ℃變性３０ ｓ，Ｔｍ退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，３５個(gè)循環(huán)；７２ ℃延伸６ ｍｉｎ。首先采用程序①，以ＢＪ－２９９和Ｔｘ６２２Ｂ的基因組ＤＮＡ為模板進(jìn)行擴(kuò)增，使用２．５％瓊脂糖凝膠電泳篩選出條帶清晰、穩(wěn)定、單一、明亮的引物，結(jié)果不好的引物采用程序②擴(kuò)增，如有需要再進(jìn)行個(gè)別優(yōu)化，并對(duì)該篩選出的最佳體系進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。然后使用優(yōu)化后的ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)程序，以５個(gè)高粱品種的基因組ＤＮＡ作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。參照Ｂａｓｓａｍ等［２３］，采用６％變性聚丙烯酰胺變性凝膠電泳對(duì)耐鹽堿品種ＢＪ－２９９和鹽敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分離檢測(cè)，在愛(ài)普生凝膠掃描儀上進(jìn)行掃描并保存圖像。

２ 結(jié)果與分析

２．１ ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)程序的建立

以ＢＪ－２９９和Ｔｘ６２２Ｂ的基因組ＤＮＡ為模板，采用程序①對(duì)２５０對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)２．５％瓊脂糖凝膠電泳，共篩選出２１８對(duì)引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰、穩(wěn)定、單一、明亮（圖１），占總擴(kuò)增引物的８７．２％。退火溫度在５５～５７ ℃時(shí)，大多數(shù)引物的擴(kuò)增效果較好；當(dāng)退火溫度超過(guò)６０ ℃時(shí)，大多數(shù)引物的擴(kuò)增條帶明顯變?nèi)酢?/p>

采用程序②擴(kuò)增程序①未擴(kuò)增成功的３２對(duì)引物，結(jié)果有３對(duì)引物擴(kuò)增出條帶清晰、穩(wěn)定、單一的產(chǎn)物，占總引物的１．2％，且當(dāng)退火溫度在５５～５７ ℃時(shí)，３對(duì)引物均可以得到較好的擴(kuò)增效果（圖２）。對(duì)于程序①和程序②都沒(méi)有擴(kuò)增成功的引物，采用提高模板濃度以及降低退火溫度等措施繼續(xù)優(yōu)化，結(jié)果只有２對(duì)引物優(yōu)化成功，其余引物則不再進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件共初步篩選出２２３對(duì)引物，占總引物數(shù)的８９．２％。

２．2 ＳＳＲ－ＰＣＲ反應(yīng)體系的驗(yàn)證及多態(tài)引物篩選

以５個(gè)品種的基因組ＤＮＡ為模板，對(duì)初篩得到的２２３對(duì)ＳＳＲ引物及優(yōu)化后的ＰＣＲ擴(kuò)增程序進(jìn)行驗(yàn)證，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物（圖３），同時(shí)用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)耐鹽堿品種ＢＪ－２９９和鹽敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖４）。結(jié)果表明，所有引物均產(chǎn)生了清晰的擴(kuò)增條帶，且大多數(shù)引物無(wú)雜帶或拖帶現(xiàn)象，可見(jiàn)共有２２３對(duì)引物的ＰＣＲ反應(yīng)體系優(yōu)化成功。此外，瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，２２３對(duì)引物中有１２５對(duì)在耐鹽堿品種ＢＪ－２９９與鹽堿敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ間表現(xiàn)多態(tài)性，多態(tài)率為５６．０５％，多態(tài)性引物在高粱染色體上的分布及平均物理距離見(jiàn)表１。

３ 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化ＰＣＲ反應(yīng)的退火溫度和反應(yīng)程序，獲得了２２３對(duì)能在５個(gè)高粱品種中穩(wěn)定擴(kuò)增的引物，還有２７對(duì)引物未能擴(kuò)增成功，可能是反應(yīng)體系、擴(kuò)增程序還需進(jìn)一步優(yōu)化，也有可能是引物本身質(zhì)量不高或引物序列合成錯(cuò)誤，有待于進(jìn)一步研究。

實(shí)驗(yàn)初步篩選出的２２３對(duì)引物的在高粱染色體上的平均物理距離為２．９１ Ｍｂ，最大為３．１５ Ｍｂ，最小為２．６０ Ｍｂ。共發(fā)現(xiàn)１２５對(duì)引物在耐鹽堿品種ＢＪ－２９９與鹽堿敏感品種Ｔｘ６２２Ｂ間具有多態(tài)性，其平均物理距離為5．40 Ｍｂ，最大為９．３５ Ｍｂ，最小為３．３６ Ｍｂ。這些引物可作為該高粱群體耐鹽ＱＴＬ分析的ＳＳＲ標(biāo)記［２４］，為開(kāi)展分子標(biāo)記輔助選擇高產(chǎn)耐鹽品系提供參考。

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