比色法測定刺槐花中總皂苷含量

摘要：建立了比色法測定刺槐（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ Ｌ．）花提取物總皂苷含量的方法。以人參皂苷Ｒｇ１作為對照品，通過正交設計對香草醛－高氯酸比色法的試驗條件進行優(yōu)化，確定最佳比色條件為：６０ ℃水浴揮干溶劑后，加入０．２ ｍＬ ７.0％香草醛－冰乙酸液和１ ｍＬ高氯酸，于６０ ℃水?。玻?ｍｉｎ，測定波長為５４５ ｎｍ。樣品在０～０．２４ ｍｇ范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為ｙ＝３．５４７ ０ｘ＋０．０１０ ９（Ｒ２＝０．９９８ ９），平均加樣回收率為１００．０７％（ＲＳＤ＝２．１０％，ｎ＝７），測得刺槐花提取物中總皂苷平均含量為２．１７７％。該方法簡便、準確、重現(xiàn)性與穩(wěn)定性較好，可用于測定刺槐花提取物總皂苷含量。

關鍵詞：刺槐（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ Ｌ．）花；總皂苷；含量測定；比色法

中圖分類號：Ｏ６５７．３２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3846-04

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｓａｐｏｎｉｎｓ ｉｎ Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ Ｌ． Ｆｌｏｗｅｒｓ ｂｙ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ

ＪＩ Ｈｏｎｇ－ｆａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｌｉｎｇ－ｗｅｎ１，２，ＹＡＮＧ Ｍｉｎｇ－ｄｕｏ２，ＬＩ Ｂｉｎ１，ＹＡＮ Ｚｈｅｎ－ｍｉｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｆａｎ１

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｐｏｓｔｄｏｃｔｏｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｏｏｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｈａｒｂｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｅ，

Ｈａｒｂｉｎ １５００７６， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ Ｌ． ｆｌｏｗｅｒｓ （ＲＰＦ） ｂｙ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ． Ｗｉｔｈ Ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｇ１ ａｓ ｓｔａｎｄａｒｄ material， ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｎｉｌｌｉｎ－ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ． Ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ： ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｗａｓ ｅｖａｐｏｒａｔｅｄ ｂｙ ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ ｈｅａｔｉｎｇ ａｔ ６０ ℃， ａｎｄ ｗａｓ ｍｉｘｅｄ ｗｉｔｈ ０．２ ｍＬ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ７.0％ ｖａｎｉｌｌｉｎ ａｎｄ １ ｍＬ ｐｅｒｃｈｌｏｒｉｃ ａｃｉｄ， ａｎｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ ｗａｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ａｔ ６０ ℃ ｆｏｒ ２０ ｍｉｎ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ５４５ ｎｍ． Ａ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０～０．２４ ｍｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｙ＝３．５４７ ０ｘ＋０．０１０ ９（Ｒ２＝０．９９８ ９）， ａｎｄ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ １００．０７％（ＲＳＤ＝２．１０％，ｎ＝７）． Ｔｈｅ average content of ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｉｎ ＲＰＦ ｗas ２．１７７％． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｉｍｐｌｅ， ａｃｃｕｒａｔｅ， ｅｘｃｅｌｌｅｎｔｌｙ ｓｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ， ａｎｄ ｗａｓ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｉｎ ＲＰＦ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ Ｌ． ｆｌｏｗｅｒｓ； ｔｏｔａｌ ｓａｐｏｎｉｎｓ； ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｔｅｎｔ； ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｙ

刺槐（Ｒｏｂｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ Ｌ．）又稱洋槐，是主要的速生造林樹種之一，在我國分布廣泛，目前我國剌槐面積約有１５０萬ｈｍ２，資源豐富［１］。刺槐花系豆科植物刺槐的干燥花，味澀、平、入肝經(jīng)，始載于《貴州民間方藥集》，具有消癰化瘀、清熱解毒、療咽治痔、健胃通腸等功效。刺槐花含有豐富的蛋白質［２］、氨基酸［３］、微量元素［４］、多酚類［５］、黃酮類［６］等化合物，具有較高的食用價值和藥用價值。目前，對刺槐花化學成分及活性的研究較多［５－７］，但鮮見有總皂苷定量方法的研究報道。皂苷是生理活性廣泛的一種特殊的苷類，普遍具有抗炎抑菌、抗腫瘤、降膽固醇、祛痰止咳、祛風濕、免疫調節(jié)、興奮或抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用［８］，已成為食品與營養(yǎng)學研究的熱點之一。準確測定刺槐花中總皂苷的含量對確保其療效和藥物開發(fā)具有重要的意義。

香草醛－高氯酸法能與皂苷作用形成特征紫紅色，且靈敏度與精密度較高，受糖類干擾較小，所用儀器設備簡單、結果可靠、重復性好，是一般實驗室測定總皂苷含量最廣泛采用的顯色方法。反應機理是皂苷在強氧化性酸的作用下脫氫，氧化后再與香草醛起加成反應［９］。本試驗以香草醛－高氯酸為顯色劑，采用紫外－可見分光光度法優(yōu)化了槐花總皂苷最佳的測試條件，并建立了簡便準確的定量方法。

１ 材料與方法

１．１ 試劑與儀器

槐花購自新鄉(xiāng)洪門市場；人參皂苷Ｒｇ１標準品（上海同田生物技術有限公司）；其他化學試劑均為分析純。

ＲＥ－５２Ａ旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；ＷＦＪ７２００可見光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；ＴＵ－１８１０ＰＣ型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；ＳＨＣ－Ａ水浴振蕩器（江蘇金壇中大儀器廠）。

１．２ 實驗方法

１．２．１ 溶液的配制

１）樣品溶液的制備：準確稱取冷凍干燥粉碎槐花樣品２ ｇ于２５０ ｍＬ碘量瓶中，加入５０ ｍＬ ８０％乙醇為提取溶劑，浸泡３０ ｍｉｎ后，５０ ℃水浴振蕩提取２ ｈ，收集濾液，濾渣于相同條件下再提?。贝?，合并２次濾液，定容至１００ ｍＬ，水飽和正丁醇萃?。泊危占〈紝?，真空濃縮得總皂苷，配制成一定濃度甲醇溶液備用。

２）標準溶液的配制：稱取干燥至恒重的人參皂甙Ｒｇ１ ４．８ ｍｇ，用１０ ｍＬ ６０％乙醇溶解，配制成０．４８ ｍｇ／ｍＬ標準溶液。

１．２．２ 最大吸收波長的確定 分別取０．３ ｍＬ人參皂苷標準品溶液與０．１２５ ｍＬ樣品溶液，６０ ℃水浴揮干溶劑，加入新配制的０．２ ｍＬ ５％香草醛－冰乙酸液，０．８ ｍＬ高氯酸，６０ ℃水浴加熱１５ ｍｉｎ，冷卻，加５ ｍＬ冰乙酸，混勻靜置２０ ｍｉｎ，在紫外－可見分光光度計上，２００～９００ ｎｍ范圍內掃描，以６０％乙醇溶液進行空白試驗。

１．２．３ 顯色條件單因素與正交實驗優(yōu)化 在單因素實驗的基礎上，選擇香草醛濃度、高氯酸用量、反應溫度與反應時間等４個主要因素進行Ｌ９（３４）正交實驗，因素水平見表１。

１．２．４ 方法學考察 對方法的穩(wěn)定性、精密度、重現(xiàn)性、加標回收率進行測定，并對槐花樣品總皂苷含量進行了測定。

２ 結果與分析

２．１ 最大吸收波長的確定

人參皂苷Ｒｇ１標準品與供試樣品顯色后的紫外－可見光譜掃描圖分別如圖１、圖２所示。結果表明，人參皂苷和供試樣品在２００～９００ ｎｍ波長范圍內均在５４５ ｎｍ處有最大吸收峰，因此可用人參皂苷Ｒｇ１作為對照品測定槐花總皂苷。

２．２ 香草醛－高氯酸法比色條件的優(yōu)化

２．２．１ 反應溫度對顯色反應的影響 準確量取供試樣品０．１２５ ｍＬ置于１０ ｍＬ具塞試管中，于 ６０ ℃水浴使溶劑揮發(fā)。按“１．２．２”中香草醛－高氯酸法顯色，僅改變反應溫度，測定ＯＤ５４５ nm，考察反應溫度對顯色反應的影響。 由圖３可見，反應溫度對顯色結果有較大影響，隨著反應溫度的升高，吸光度值也不斷增加，但到８０ ℃后，反應體系的顏色非常深，因此選擇反應溫度為７０ ℃。

２．２．２ 加熱時間對顯色反應的影響 準確量取供試樣品０．１２５ ｍＬ置于１０ ｍＬ具塞試管中，于 ６０ ℃水浴使溶劑揮發(fā)。按“１．２．２”中香草醛－高氯酸法顯色，于 ６０ ℃水浴中分別加熱不同時間，測ＯＤ５４５ nm，考察加熱時間對顯色反應的影響。由圖４可見，隨著加熱時間的延長，吸光度呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，５ ｍｉｎ時吸光度最低，２０ ｍｉｎ時吸光度最高，顯色完全。因此，選擇加熱時間為２０ ｍｉｎ。

２．２．３ 高氯酸用量對顯色反應的影響 準確量取供試樣品０．１２５ ｍＬ置于１０ ｍＬ具塞試管中，于 ６０ ℃水浴使溶劑揮發(fā)。加入０．２ ｍＬ ５％香草醛－冰乙酸溶液，分別加入高氯酸０．２、０．４、０．６、０． ８、１．０、１．２、１．４ ｍＬ，搖勻，６０ ℃水浴加熱 １５ ｍｉｎ，取出后立即用流水冷卻，依次加入冰乙酸 ５．６、５．４、５．２、５．０、４．８、４．６、４．４ ｍＬ稀釋，以不加供試樣品的平行樣為空白，測ＯＤ５４５ nm，考察高氯酸用量對顯色反應的影響。由圖５可見，高氯酸用量太少，吸光度較低，對反應結果影響較大。隨著高氯酸用量的增加，整體趨勢呈先上升后下降，高氯酸用量為０．８ ｍＬ時吸光度最大。

２．２．４ 香草醛濃度對顯色反應的影響 準確量取供試樣品０．１２５ ｍＬ置于１０ ｍＬ具塞試管中，于６０ ℃水浴使溶劑揮發(fā)。分別加入新配制的不同濃度的香草醛－冰乙酸溶液０．２ ｍＬ，按“１．２．２”中方法顯色后，測ＯＤ５４５ nm，考察香草醛濃度對顯色反應的影響。由圖６可見，香草醛濃度為０．５％～１.0％時，吸光值較低；隨著香草醛濃度的增加，吸光度呈上升趨勢，到９.0％后，吸光度上升趨勢減緩。香草醛作為顯色劑，要求過量即可，太高濃度會使測定的背景值加深。因此，５.0％～９.0％的香草醛是比較適宜的。

２．２．５ 正交設計優(yōu)化 在單因素實驗基礎上，采用Ｌ９（３４）正交實驗設計對槐花總皂苷香草醛－高氯酸法比色條件進行優(yōu)化，結果見表２。

極差大小可以用來表征各因素對顯色反應的影響程度。由表２可以看出，各因素對顯色反應影響的大小順序為：反應溫度、反應時間、高氯酸用量、香草醛濃度。確定槐花總皂苷最佳比色條件為（Ａ２Ｂ２Ｃ３Ｄ２）：香草醛濃度７.0％、高氯酸用量１ ｍＬ、反應溫度６０ ℃、反應時間２０ ｍｉｎ。

２．３ 標準曲線制作

準確吸取標準溶液０．１、０．２、０．３、０．４、０．５ ｍＬ于１０ ｍＬ具塞試管中，６０ ℃水浴揮干溶劑后，加入新配制的７.0％香草醛－冰乙酸液０．２ ｍＬ，高氯酸１ ｍＬ，６０ ℃水浴加熱２０ ｍｉｎ，冷卻，加冰乙酸４．８ ｍＬ，混勻靜置２０ ｍｉｎ，測ＯＤ５４５ ｎｍ，以６０％乙醇溶液做空白試驗。以吸光度為縱坐標，皂苷濃度為橫坐標，繪制標準曲線?；貧w方程為ｙ＝３．５４７ ０ｘ＋０．０１０ ９，Ｒ２＝０．９９８ ９。

２．４ 方法學考察

２．４．１ 穩(wěn)定性 按標準曲線項下所述方法進行顯色，分別放置不同時間后，測定吸光度，每個測定時間重復３次。由圖７可見，隨著放置時間的延長，吸光度整體呈現(xiàn)下降趨勢，６０ ｍｉｎ以內吸光度變化不明顯，１２０ ｍｉｎ后吸光度值開始下降。結果表明，樣品在６０ ｍｉｎ以內比較穩(wěn)定，可以滿足測定的需求。

２．４．２ 精密度 取樣品溶液５份，按標準曲線項下所述方法顯色，測定吸光值分別為０．６７８、０．６９９、０．６８６、０．６５８、０．６９２，計算得出相對標準偏差（ＲＳＤ）為２．３２％，表明該方法精密度較高。

２．４．３ 重現(xiàn)性 精確稱?。?ｇ粉碎后槐花樣品５份，按“１．２．１”提取槐花總皂苷。各?。埃保玻?ｍＬ，平行３次，按標準曲線法測定其吸光度。結果顯示ＲＳＤ僅為１．７６％，表明該方法重現(xiàn)性較好。

２．４．４ 加標回收率 ?。埃保玻?ｍＬ已知總皂苷含量的樣品溶液７份于具塞試管中，加入０．４８ ｍｇ／ｍＬ的標準品溶液５０ μＬ，按標準曲線法于ＯＤ５４５處測定其吸光度。由表３可知，該方法的平均回收率為１００．０７％，ＲＳＤ為２．１０％，表明該方法準確度較高。

２．５ 槐花樣品總皂苷含量測定

精確稱取２ ｇ粉碎后樣品５份，按“１．２．１”提取槐花總皂苷。測定其吸光度，并代入回歸方程計算總皂苷的含量。由表４可知，槐花樣品總皂苷的平均含量為２．１７７％，ＲＳＤ為１．４９％。

３ 小結與討論

在香草醛－高氯酸法顯色與測定總皂苷的過程中，香草醛濃度、高氯酸用量、反應溫度、反應時間等因素起著關鍵的作用，直接決定著吸光度的大小與靈敏度的高低。因此，試驗優(yōu)選了分析的最佳條件，對最大吸收波長、香草醛濃度、高氯酸用量、反應溫度與反應時間分別進行了考察。

槐花總皂苷香草醛－高氯酸法最佳顯色條件為：準確吸取一定體積的樣品溶液，６０ ℃水浴揮干溶劑，加入新配制的７.0％香草醛－冰乙酸液０．２ ｍＬ，高氯酸１ ｍＬ，６０ ℃水浴加熱２０ ｍｉｎ，冷卻，加冰乙酸４．８ ｍＬ，混勻靜置２０ ｍｉｎ，測ＯＤ５４５ nm，以６０％乙醇溶液隨行空白?；貧w方程為ｙ＝ ３．５４７ ０ｘ＋ ０．０１０ ９，Ｒ２＝０．９９８ ９。

該方法穩(wěn)定性與重現(xiàn)性較好，精密度較高（ＲＳＤ＝２．３２％，ｎ＝５），加標回收率為１００．０７％（ＲＳＤ＝２．１０％，ｎ＝７），準確度較高?；被悠房傇碥蘸科骄鶠椋玻保罚罚?。該方法操作簡便、靈敏、準確，適用于實驗室中測定槐花總皂苷的含量。

參考文獻：

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