富硒桑葚果酒蘆丁和槲皮素含量的分析

摘要：利用原子熒光分光光度法測定了桑葚果酒中硒的含量。采用單因素考察法優(yōu)化桑葚果酒中蘆丁、槲皮素的提取條件，采用ＨＰＬＣ法測定蘆丁、槲皮素的含量，色譜柱為Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ），測定蘆丁以乙腈－０．１％磷酸（體積比１９∶８１）為流動相，測定槲皮素以甲醇－０．４％磷酸（體積比1∶1）為流動相，流速為１．０ ｍＬ／ｍｉｎ，檢測波長為３６０ ｎｍ，柱溫為３０ ℃。結(jié)果表明，所選桑葚釀造的果酒中硒含量為（０．０１５ ３±０．００１ ２）ｍｇ／ｍＬ。槲皮素在２．０２～４０．４０ μｇ呈良好線性關(guān)系（Ｒ２＝０．９９９ ９），平均回收率為９８．８８％，ＲＳＤ為１．１９％（ｎ＝５）。試驗結(jié)果為安康富硒桑葚果酒的開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：桑葚果酒；蘆?。婚纹に?；ＨＰＬＣ法

中圖分類號：Ｏ６５７．７＋２ 文獻標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3842-04

Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｎｔｅｎ ｏｆ Ｒｕｔｉｎ ａｎｄ Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｉｎ Ｓｅｌｅｎｉｕｍ－Rｉｃｈ Ｍｕｌｂｅｒｒｙ Ｗｉｎｅ

ＹＡＮＧ Ｆａｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ Ａｎｋａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｆｏｏｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｈａaｎｘｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ａｎｋａｎｇ ７２５０００， Ｓｈａａｎｘｉ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Atomic fluorescence spectrum was ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｏｆ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｗｉｎｅ． Ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｉｎ ｓｅｌｅｎｉｕｍ－ｒｉｃｈ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｗｉｎｅ， and HPLC method was ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ｏｎ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）ｗｉｔｈ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ－０．１％ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ （１９∶８１，V/V） ａｎｄ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｍｅｔｈａｎｏｌ－０．４％ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ （1∶1，V/V） ａｓ ａ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｔ ｔｈｅ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ １．０ ｍＬ／ｍｉｎ． Ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ were ｄｅｔｅｃｔｅｄ ａｔ ３６０ ｎｍ，ａｎｄ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０ ℃． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｌｅｎｉｕｍ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｗｉｎｅ was （０．０１５ ３±０．００１ ２） ｍｇ／ｍＬ． Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｏｆ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｗａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ２．０２～４０．４０ μｇ with R2=0.999 9． The average recovery of quercetin was 98.88% and RSD was 1.19%（n=5）. Ｔｈｉｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｃｅｒｔａｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｅ－ｒｉｃｈ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｗｉｎｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｓｅｌｅｎｉｕｍ－ｒｉｃｈ ｍｕｌｂｅｒｒｙ ｗｉｎｅ； ｒｕｔｉｎ； ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ； ＨＰＬＣ ｍｅｔｈｏｄ

硒是人體必需的微量元素之一，以硒代半胱氨酸的形式構(gòu)成谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心，該酶可清除自由基，保護細(xì)胞免受自由基的損傷。硒有增強機體免疫，提高機體抗氧化能力等生理功能。近些年，硒對人類健康的重要性越來越受到重視。經(jīng)普查，安康市由于獨特的地質(zhì)地理環(huán)境，形成了以紫陽、鎮(zhèn)坪、平利、嵐皋、石泉、漢陰、漢濱區(qū)為代表，其地質(zhì)巖層、土壤及水質(zhì)含硒量明顯高于全國其他地區(qū)，富硒面積居全國第一。安康全市大面積的土壤，多數(shù)的農(nóng)作物、經(jīng)濟作物硒含量均顯著高于其他地區(qū)，具有發(fā)展富硒食品的獨特優(yōu)勢。

桑葚為桑科落葉喬木桑樹的果實，每年４～６月份成熟，在全國各省市均有分布。我國共有１５個種４個變種３ ０００多個種質(zhì)資源［１］。桑葚化學(xué)成分復(fù)雜，營養(yǎng)豐富。桑葚現(xiàn)已被國家衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”的農(nóng)產(chǎn)品之一，具有很高的藥用價值。桑葚具有抗氧化［２］、抗疲勞［３，４］、增強免疫［５］、降血脂、抗動脈粥樣硬化［６］等藥理作用。蘆丁由槲皮素３位上的羥基與蕓香糖脫水合成的苷，是桑葚的有效成分之一。蘆丁有助于保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性，主要用作防治高血壓病的輔助治療劑。槲皮素是構(gòu)成蘆丁的苷元，具有較好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用。此外還有降低血壓、增強毛細(xì)血管抵抗力、減少毛細(xì)血管脆性、降血脂、擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量，保護心肌缺血再灌注損傷和抑制心肌肥厚等作用。

本研究選用安康富硒桑葚釀造桑葚果酒，測定了果酒中硒、蘆丁、槲皮素含量，為后期安康富硒桑葚果酒開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

桑葚分別采摘自安康市漢濱區(qū)張灘鎮(zhèn)桑園基地（前期測定其中硒含量為０．０３５ ２±０．００３ ２ ｍｇ／ｋｇ）；菌種為安琪酵母；冰糖、白砂糖均為一級。

１．２ 儀器與試劑

ＰＦ６－２型非色散原子熒光分光光度計；ＳＹ２２００－Ｔ型超聲波清洗機；ＢＰ２１１Ｄ電子分析天平；ＤＡ－１３０Ｎ酒精度計；美國Ａｇｉｌｅｎｔ １２００高效液相色譜儀，在線真空脫氣機（Ｇ－１３７９Ｂ），高壓四元泵（Ｇ－１３１１Ａ），二極管陣列檢測器，Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ Ｓｅｒｉｅｓ色譜工作站，標(biāo)準(zhǔn)自動進樣器（Ｇ－１３２９Ａ），智能化柱溫箱（Ｇ－１３１６Ａ），可變波長檢測器（Ｇ－１３１４Ｂ）。

蘆丁對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為１００８０－２００７０７）。槲皮素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為１００８１－２００９０７）。乙腈、甲醇為色譜純（天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）、其他試劑均為分析純；水為超純水。

１．３ 方法

１．３．１ 桑葚果酒的釀制 采摘新鮮成熟桑葚，去除桑葚枝葉后用清水洗凈，烘干。用破碎機對樣品進行破碎。根據(jù)果醪量，按０．０１５％加入安琪酵母，１０∶１的比例加入白砂糖和冰糖（質(zhì)量比１∶１）。裝入發(fā)酵罐中，用保鮮膜將罐口扎緊密閉。貼上標(biāo)簽，注明制作日期。室溫下（２０～２５ ℃）陰暗處靜置２０ ｄ。發(fā)酵期間，用牙簽在封口保鮮膜上扎小孔排氣。

１．３．２ 桑葚果酒酒精度的測定 將發(fā)酵液過濾后，取適量的濾液用ＤＡ－１３０Ｎ酒精度計測定桑葚果酒中乙醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

１．３．３ 桑葚果酒中硒含量的測定 供試品溶液的制備：精確量取桑葚果酒樣品１．０ ｍＬ于１００．０ ｍＬ錐形瓶中，加入１５．０ ｍＬ混酸（硝酸∶高氯酸＝３∶２，Ｖ／Ｖ），在１６０ ℃自動控溫消化爐上消化過夜１２ ｈ左右。次日將三角瓶放于可調(diào)式加熱板上熱消化至２ ｍＬ左右。同時以上述同樣方法做一組空白對照。待消化結(jié)束取下至冷卻后向三角瓶中加入５．０ ｍＬ鹽酸溶液（鹽酸∶水＝１∶１，Ｖ／Ｖ）后，水浴加熱２０ ｍｉｎ后取出，冷卻，再加入５．０ ｍＬ蒸餾水。過濾后定容至２５．０ ｍＬ，搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：分別移取硒標(biāo)準(zhǔn)工作溶液０、４．０、８．０、１２．０、１６．０ ｍＬ置于２５．０ ｍＬ容量瓶中，用５％鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，按照儀器工作條件測定系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

設(shè)定好儀器工作條件，輸入樣品質(zhì)量、定容體積等相關(guān)參數(shù)，原子化器點火，儀器預(yù)熱２０ ｍｉｎ。啟動自動進樣系統(tǒng)，依次測定空白溶液、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液的熒光強度。

１．３．４ 桑葚果酒蘆丁含量的測定 樣品的前期處理：?。保?ｍＬ的桑葚果酒加入等體積的８０％乙醇，待產(chǎn)生沉淀后蒸干，取適量的５０％甲醇溶解后定容至５ ｍＬ。

色譜條件：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８色譜柱（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）；流動相乙腈－０．１％磷酸（體積比１９∶８１）［７］；檢測波長３６０ ｎｍ；流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫３０℃；進樣體積１０ μＬ。

對照品溶液的制備：精密稱取蘆丁對照品２．５０ ｍｇ，置于２５ ｍＬ容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為０．１０ ｇ／Ｌ的蘆丁對照品溶液。

１．３．５ 桑葚果酒槲皮素含量的測定 樣品預(yù)處理：?。玻?ｍＬ的桑葚果酒置于１００ ｍＬ容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過濾，取濾液，進樣１０ μＬ。

色譜條件：Ｋｒｏｍａｓｉｌ Ｃ１８色譜柱（４．６ ｍｍ×１５０ ｍｍ，５ μｍ）；流動相甲醇－０．４％磷酸（體積比１∶１）［８］；檢測波長３６０ ｎｍ；流速１．０ ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫３０ ℃；進樣體積１０ μＬ。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 桑葚果酒感官評價

其色紫紅澄清明亮、味甘略酸、醇香，具有明顯的桑葚特征。

２．２ 酒精度測定

測得桑葚果酒的酒精度為１２％。

２．３ 桑葚果酒中硒含量的測定

按試驗方法對硒系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進行測定，硒的質(zhì)量濃度與其對應(yīng)的熒光強度呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程ｙ＝０．０１４ｘ＋０．３０６，R2=０．９９９ 0。桑葚果酒樣品中硒含量為（０．０１５ ３±０．００１ ２） ｍｇ／ｍＬ。

２．４ 桑葚果酒中蘆丁含量的測定

采用上述色譜條件對蘆丁進行檢測，蘆丁的保留時間為６．０００ ｍｉｎ，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖１，桑葚果酒樣品蘆丁的色譜圖見圖２。５批桑葚果酒樣品中蘆丁含量的平均值為（０．００３ ６±０．０００ ７） ｍｇ／１００ ｍＬ。

２．５ 桑葚果酒中槲皮素含量的測定

２．５．１ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取槲皮素對照品溶液（０．１０１ ０ ｇ／Ｌ），在上述色譜條件下分別進樣２、３、１０、２０、４０ μＬ，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，線性回歸方程為Ａ＝３６．５５７ ０Ｃ＋２．０１９ ２，Ｒ２＝０．９９９ ９，表明在線性范圍內(nèi)（２．０２～４０．４０ μｇ）線性關(guān)系良好。

２．５．２ 方法學(xué)研究 精密度試驗：以槲皮素對照品溶液（含槲皮素０．１０１ ０ ｇ／Ｌ），重復(fù)進樣５次，每次進樣１０ μＬ，記錄色譜峰面積，色譜峰面積的ＲＳＤ為０．６２％，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取同一樣品５份，按上述樣品前處理方法和色譜條件測定含量，分別為０．０３５ ２、０．０３５ ７、０．０３４ ２、０．０３４ ７、０．０３５ ５ ｍｇ／ｍＬ，平均值為０．０３５ １ ｍｇ／ｍＬ，ＲＳＤ為１．７４％。表明分析方法重復(fù)性良好。穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一供試樣品溶液１０ μＬ，每隔４ ｈ進樣１次，重復(fù)進樣５次，記錄色譜峰面積，色譜峰面積的ＲＳＤ為０．８７％。表明供試樣品溶液在１６ ｈ內(nèi)穩(wěn)定?；厥章试囼灒壕芰咳⊥还┰嚇悠罚保?ｍＬ ５份，每份分別加１０ ｍＬ槲皮素對照品甲醇溶液（０．０３７ ５ ｍｇ／ｍＬ），按“重復(fù)性試驗”項下方法測定含量后，計算回收率。槲皮素回收率結(jié)果見表１。

２．５．３ 樣品測定 采用上述色譜分析條件對槲皮素進行檢測，槲皮素的保留時間為７．８９１ ｍｉｎ，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖見圖３，桑椹果酒樣品的色譜圖見圖４。５批桑葚果酒樣品中槲皮素含量的平均值為（０．０３５ ３±０．００１ ７） ｍｇ／ｍＬ。

３ 小結(jié)與討論

鮮桑葚水分含量高，糖類豐富，常溫下１～２ ｄ即變色、變味、腐爛，所以對桑葚及時加工有利于緩解鮮果成熟期集中、保鮮期短而引起的保藏與消費的矛盾。桑葚酒就是鮮桑葚的重要深加工產(chǎn)品之一。作為一種極富營養(yǎng)價值和保健功能的果酒，桑葚酒也越來越受現(xiàn)代養(yǎng)生保健一族的青睞。

桑葚中黃酮主要為蘆丁和槲皮素。耿旦［７］的研究表明，桑葚中蘆丁的含量在０．１９５ １～０．５１０ ４ ｍｇ／ｇ。本研究表明，桑葚果酒蘆丁含量甚少，分析在桑葚果酒的釀造過程中，大部分蘆丁可能被苷酶水解為槲皮素，故未對蘆丁含量測定做詳細(xì)的方法學(xué)考察。

本研究以漢濱區(qū)張灘鎮(zhèn)產(chǎn)桑葚釀制果酒樣品中硒含量為（０．０１５ ３±０．００１ ２） ｍｇ/ｍＬ；槲皮素含量為（０．０３５ ３±０．００１ ７） ｍｇ/ｍＬ。

近年來研究表明，槲皮素還能顯著抑制血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖，對于肺動脈高壓的防治具有重要作用。也已有人證實了槲皮素能抑制Ｒｏｕｓ肉瘤病毒和誘發(fā)腫瘤的人皰疹病毒［９］；可以阻斷雄激素對激素依賴型的人類前列腺癌細(xì)胞的作用［１０］；槲皮素作為ＤＮＡ拓?fù)洚悩?gòu)酶有效抑制劑，對多種病毒的復(fù)制具有抑制作用［１１－１５］?？梢?，槲皮素具有很強的生物學(xué)活性及廣泛的藥理作用，對人類腫瘤、心血管病、衰老治療和預(yù)防有重要意義。本研究表明安康富硒桑葚釀造的果酒硒、槲皮素含量豐富。該結(jié)果為后期開發(fā)安康富硒桑葚果酒奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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