不同ｐＨ值和鹽離子濃度對ＥＶ７１疫苗純化的影響研究

摘要：為了考察腸道病毒71型（ＥＶ７１）抗原（培養(yǎng)原液及層析液）在不同ｐＨ下的穩(wěn)定性以及鹽離子濃度可能對病毒粒子的聚集產(chǎn)生的影響，試驗通過對ＥＶ７１病毒培養(yǎng)原液的濃縮（即抗原的粗純）和４ＦＦ層析后發(fā)現(xiàn)抗原在ｐＨ ３～９，２～８ ℃放置１周都很穩(wěn)定，同時樣品中不加ＮａＣｌ，緩沖液中含０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ可以提高抗原的收率。

關鍵詞：腸道病毒７１型（ＥＶ７１）；純化疫苗；ｐＨ值；鹽離子濃度

中圖分類號：Ｒ３７３．２ 文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3791-03

Ｔｈｅ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ Ｖａｌｕｅ ａｎｄ Ｓａｌｔ Ｉｏｎｓ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ＥＶ７１ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ

ＬＩＮ Ｆａｎｇ

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＥＶ７１ ａｎｔｉｇｅｎ（ｃｕｌｔｕｒｅ ｌｉｑｕｉｄ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ） ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｂａｂｌｙ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｓａｌｔ ｉｏｎｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ＥＶ７１ ｖｉｒｕｓ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｓａｌｔ ｉｏｎｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｎｔｉｇｅｎ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐＨ ３～９， ２～８ ℃ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｆｔｅｒ one ｗｅｅｋ． Bｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ containing 0.1 mol/L NaCl ｃｏｕｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｇｅｎ recovering ｒａｔｅ ｉｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ was wｉｔｈｏｕｔ ＮａＣｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： eｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１（ＥＶ７１）； vaccine ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｐＨ ｖａｌｕｅ； ｓａｌｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

手足口病（Ｈａｎｄ－ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ， ＨＦＭＤ）是由腸道病毒引起的一種兒童常見急性傳染病，在全球廣泛分布，無明顯的地域分布［１，２］。多以３歲以下年齡組發(fā)病率最高［３］。大多數(shù)患者癥狀輕微，臨床診斷以發(fā)熱和手、足、口、臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹為主要表現(xiàn)，可伴有上呼吸道感染癥狀［４］。

腸道病毒７１型（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１，ＥＶ７１）是?。遥危敛《究迫四c道病毒屬的成員［５，６］，主要在腸道內(nèi)進行復制［７］。目前已知柯薩奇病毒Ａ４、Ａ５、Ａ８、Ａ１０、Ａ１６、Ｂ３、Ｂ７和ＥＶ７１型等多種腸道病毒均可引起手足口病，但ＥＶ７１是引起手足口病的主要病原體［８，９］。該病毒具有較強的傳染性，是暴發(fā)流行的優(yōu)勢病毒，引起的感染具有較高的重癥率和病死率［１０］。由于ＥＶ７１的免疫學發(fā)病機制較為復雜，相關研究報道不多，本研究通過反復試驗和摸索，對純化中鹽離子濃度、平衡液ｐＨ值的條件進行了篩選和優(yōu)化，得到了穩(wěn)定的純化疫苗，確定了疫苗純化所需適宜的ｐＨ和鹽離子濃度。

１ 材料和方法

１．１ 材料

１．１．１ 材料 Ｖｅｒｏ 細胞（不含病毒及牛血清）；ＡＫＴＡ層析儀（美國通用電氣醫(yī)療生物科學有限公司）；Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ（美國通用電氣醫(yī)療生物科學有限公司）；紫外可見分光光度計ＵＶ－１７００（日本島津公司）；微量移液器（法國吉爾森公司）；ｐＨ儀和分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

１．１．２ 緩沖液 ①液：０．２ ｍｏｌ／Ｌ檸檬酸；②液：０．２ ｍｏｌ／Ｌ 檸檬酸鈉；③液：０．２ ｍｏｌ／Ｌ磷酸氫二鈉；④液：０．２ ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氫鈉；⑤液：０．４ ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ；⑥液：０．４ ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ。

不同ｐＨ體系緩沖液的配制如下。ｐＨ ３．０：取①液１８．６ ｍＬ加②液１．４ ｍＬ；ｐＨ ４．０：取①液１３．１ ｍＬ加②液６．９ ｍＬ；ｐＨ ５．０：?、僖海福?ｍＬ加②液１１．８ ｍＬ；ｐＨ ６．０：取③液２．５ ｍＬ加④液１７．５ ｍＬ：ｐＨ ７．０：取③液１２．２ ｍＬ加④液７．８ ｍＬ；ｐＨ ８．０：?、菀海保埃?ｍＬ用⑥液調(diào)ｐＨ至８．０然后加水至２０ ｍＬ；ｐＨ ９．０：?、菀海保埃?ｍＬ用⑥液調(diào)ｐＨ至９．０然后加水至２０ ｍＬ。

１．２ 方法

１．２．１ ｐＨ穩(wěn)定性試驗 將病毒收獲液和經(jīng)４ＦＦ層析收集一峰各８．０ ｍＬ，分別以１∶１（V/V）加入不同ｐＨ體系（ｐＨ ３、４、５、６、７、８、９）的緩沖液，這樣就形成了ＥＶ７１的不同ｐＨ環(huán)境，其中病毒收獲液的對照加入１∶１（V/V）的細胞維持液，４ＦＦ層析收集一峰的對照加入１∶１（V/V）的ＰＢＳ。在２～８ ℃放置１周檢測其滴度（細胞檢測）和效價（ＥＬＩＳＡ試劑盒檢測）。

１．２．２ 鹽離子濃度對純化的影響 在病毒培養(yǎng)后收獲液中分別加入０．１、０．２和０．３ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣl。根據(jù)病毒培養(yǎng)液加入ＮａＣｌ量在緩沖液中也加入相同量的ＮａＣｌ。然后經(jīng)４ＦＦ凝膠過濾層析，收集層析第一峰。

１．２．３ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ＦＦ層析 層析介質(zhì)：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ；柱子：ＧＥ ＸＫ２６／７０（或ＸＫ５０／１００）；柱體積：３００ ｍＬ（或１．５ Ｌ）；上樣量：１０％柱體積；線性流速：６０ ｃｍ／ｈ；收集層析第一峰。采用同一程序。樣品在上樣前加入不同質(zhì)量的ＮａＣｌ使樣品中的鹽濃度分別為０．１、０．２和０．３ ｍｏｌ／Ｌ。

２ 結(jié)果與分析

２．１ ｐＨ穩(wěn)定性試驗結(jié)果

pH穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表１。從表１可見，EV71病毒收獲液加不同ｐＨ的緩沖液當時和1周后測定的滴度都在５．０００左右，效價都在０．３００左右；４ＦＦ收集一峰滴度都在６．０００左右，效價都在０．４００左右。

２．２ 鹽離子濃度對純化的影響

層析圖譜見圖１，層析第一峰檢測結(jié)果見表２。由圖１可見，隨著鹽濃度的增加，第一峰ＵＶ ２８０ ｎｍ吸光值是隨之降低的，第三峰ＵＶ ２８０ ｎｍ吸光值是隨之升高的。由此可知隨著鹽濃度的增加，一部分大顆粒的物質(zhì)降解成小分子物質(zhì)。由表２可見，隨著鹽濃度的升高，第一峰ＥＶ７１的效價和滴度隨之降低。

３ 小結(jié)與討論

從表１的檢測結(jié)果來看，不論是培養(yǎng)原液還是４ＦＦ層析收集液中抗原在ｐＨ ３～９、２～８ ℃冰箱中放置１周都很穩(wěn)定，ｐＨ值均略有升高。從４ＦＦ層析圖中可以看到隨著加入ＮａＣｌ濃度的增加第一峰（目的峰）逐漸降低，由此可知隨著ＮａＣｌ濃度的增加抗原的收率是降低的。且０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ處理下第一峰的蛋白含量、效價及滴度均是最高的，綜合以上結(jié)果考慮，顯著提高抗原收率的措施應采用樣品中不加ＮａＣｌ，而緩沖液中加入０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ為最佳工藝。

參考文獻：

［１］ 竇建琳，安 靜． ＥＶ７１型病毒馴化與手足口病動物模型的研究進展［Ｊ］．免疫學雜志，２０１１，２７（３）：２５９－２６２．

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［３］ 李建強，李 薇，張予超，等．中國ＥＶ７１病毒ＶＰ１蛋白生物信息學分析［Ｊ］．微生物學免疫學進展，２０１０，３８（４）：１－５．

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［６］ 曹偉軍，鄭海學，楊 帆．腸道病毒７１型（ ＥＶ７１） 反向遺傳研究進展［Ｊ］． 病毒學報，２０１１，２７（６）：６５９－６１３．

［７］ ＶＡＴＡ Ａ． Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ７１： Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ［Ｊ］．Ｒｅｖ Ｍｅｄ Ｃｈｉｒ Ｓｏｃ Ｍｅｄ Ｎａｔ Ｉａｓｉ，１９７９，８３（１）：１１５－１１６．

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［１０］ ＣＨＥＮ Ｓ Ｐ，ＨＵＡＮＧ Ｙ Ｃ，ＬＩ Ｗ Ｃ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ Ａ２ ａｎｄ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ７１ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ ｔａｉｗａｎ， ２００８： ａ ｃｈｉｌｄｒｅｎ＇ｓ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ［Ｊ］． Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ，２０１０，４３（２）：９９－１０４．