龍葵果提取物的體外抑菌效果

摘要：采用微孔板法和稀釋法研究龍葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）果不同極性提取物對變異鏈球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）和大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）的體外抑菌作用。結果顯示龍葵果乙醇和水提取物對變異鏈球菌的生長有一定抑制作用；乙酸乙酯、正丁醇、乙醇及水提取物對變異鏈球菌生物膜形成有一定的抑制作用；氯仿、乙酸乙酯提取物對大腸桿菌生物膜形成有不同程度的抑制作用，濃度為１.0 ｍｇ／ｍＬ時，抑制率分別為８９．２４％、８０．２７％。

關鍵詞：龍葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）果；提取物；抗菌活性；生物膜；兩倍稀釋法

中圖分類號：Ｓ４８２．２＋９２文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）17－3748-03

Iｎ ｖｉｔｒｏ Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ Ｆｒｕｉｔ

ＷＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｘｉａ１，ＴＩＡＮ Ｌｉ２，３，ＴＩＡＮ Ｓｈｕ－ｇｅ２，３，ＷＵ Ｌｉｎｇ－ｌｉｎｇ３

（１． Ｕｒｕｍｑｉ Ｄｒｕｇ Ｗａｒｅｈｏｕｓｅ ｉｎ Ｌａｎｚｈｏｕ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ＰＬＡ，Ｕｒｕｍｑｉ ８３０００２，Ｃｈｉｎａ；

２． Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆａｍｏｕｓ Ｐｒｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｒｍｕｌａｓ， Ｕｒｕｍｑｉ ８３００１１，Ｃｈｉｎａ；

３． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ ８３００１１，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｏｌｖｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ ｆｒｕｉｔ ｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ ａｎｄ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｈａd ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｓｔｒｅｔｏｐｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ； ａｎｄ ｔｈｅ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔ， ｎ－ｂｕｔａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ， ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｅｘｔｒａｃｔ ｈａd ｐａｒｔｉａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔｒｅｔｏｐｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ． Ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔ ａｎｄ ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｈａd ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， tｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅｍ（ａｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ １.0 ｍｇ／ｍＬ） ｗａｓ ８９．２４％，８０．２７％， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ ｆｒｕｉｔ； ｅｘｔｒａｃｔ； ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ； ｂｉｏｆｉｌｍ； ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ

龍葵果為茄科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｃｅ）植物龍葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ Ｌ．）的干燥近成熟果實，又名野葡萄、苦葵、天茄子、天泡草、黑茄、樞哈拉，在新疆有著悠久的食用和藥用歷史，具有很高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用［１］。龍葵果氣味微酸微苦，收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部標準》（維吾爾藥分冊），認為其性二級干寒，具有調(diào)血解毒、清熱止渴、收斂消腫的功能，用于熱性氣管炎、咽炎、胃炎、肝炎；外敷或外洗可消腫止痛，治療頭痛、耳鼻眼疾、胃痛、胃脹；煎汁漱口治療牙齦腫痛等［２］。民間多有使用龍葵果治療消化不良、痢疾瀉下、口渴、口瘡、咽炎等癥，中藥以龍葵全草入藥，對龍葵果抑菌的研究報道很少，尚未見影響細菌生物膜形成的相關研究［３，４］。根據(jù)其臨床適用范圍，本研究選擇了存在于口腔中的變異鏈球菌和腸道中的大腸桿菌作為供試菌株，采用微孔板法和連續(xù)稀釋法進行龍葵果體外抑菌效果的驗證。

１ 材料與方法

１．１ 試驗材料

龍葵果于２０１０年４月購于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，經(jīng)新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院烏莉婭·沙衣提教授鑒定為茄科植物龍葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｉｇｒｕｍ Ｌ．）的干燥近成熟果實。

１．２ 供試菌種

大腸桿菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ＡＴＣＣ ３５２１８）、變異鏈球菌（Sｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ，ＡＴＣＣ ７００６１０）均購自中國藥品生物制品檢定所。

１．３ 試劑和儀器

腦心浸液培養(yǎng)基（ＢＨＩ）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（ＮＢ）均購自美國ＢＤ公司；結晶紫（上海研晶生物科技有限公司）；去氧膽酸鈉（Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，ＳＤ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ公司）；其余試劑均為分析純。試驗用水為蒸餾水。

ＳＰＥＣＴＲＡＭＡＸ １９０酶標儀（美國Ｍｏｌｅｃｕ１ａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ公司）；ＹＪ－８７５Ａ醫(yī)用凈化工作臺（蘇州金燕凈化設備廠）；ＤＮＰ－９１６２型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；３１１０系列ＣＯ２培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司）；ＹＸＱ－ＬＳ－ＳＩ全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)醫(yī)療設備廠）；ＲＥ－５２Ａ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

１．４ 試驗方法

１．４．１ 龍葵果提取物的制備 精確稱取干燥龍葵果粗粉２００ ｇ，用石油醚１．５ Ｌ回流提取１．５ ｈ后，過濾，濾渣依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水１．５ Ｌ回流提?。?ｈ后濾過，均重復提?。炒危瑸V液分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮減壓后得稠浸膏，再經(jīng)冷凍干燥制成粉末，密封冷藏保存。

１．４．２ 抑菌試驗

１）菌種復蘇與培養(yǎng)。將變異鏈球菌、大腸桿菌標準菌種分別置于裝有２ ｍＬ ＢＨＩ培養(yǎng)基、ＮＢ培養(yǎng)基的有蓋試管中，置于３７ ℃ ５％ ＣＯ２培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)１６ ｈ后，經(jīng)比濁法判斷試管變渾濁，說明菌種已復蘇。用滅過菌的培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基倒平板，冷卻凝固后用接種針挑取少許復蘇后的標準菌種進行劃線接種，３７ ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２４ ｈ后再進行活化，使這些菌種有較強的活力［５］。經(jīng)復蘇轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后，分別取新傳代變異鏈球菌、大腸桿菌置于已滅菌的裝有２ ｍＬ培養(yǎng)基的有蓋試管中，加入適量４０％葡萄糖，置于３７ ℃ ５％ ＣＯ２培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)２４ ｈ后，培養(yǎng)液用肉湯培養(yǎng)基稀釋，充分振蕩后用麥氏比濁管法調(diào)整菌液濃度為１０９ ＣＦＵ／ｍＬ。

２）微孔板法篩選抑菌活性。采用９６孔微孔板進行抑菌活性的快速篩選［６］。分別取變異鏈球菌、大腸桿菌懸液用培養(yǎng)液稀釋５０倍，混勻。把龍葵果的不同極性提取物溶解在適宜溶劑中制成２ ｍｇ／ｍＬ的溶液，經(jīng)微孔濾膜除菌后，在９６孔板上分別用肉湯培養(yǎng)基與大腸桿菌、變異鏈球菌作連續(xù)二倍稀釋，使含藥濃度分別為１ ０００．０、５００．０、２５０．０、１２５．０、６２．５ μｇ／ｍＬ。相同條件下，以純二甲亞砜作溶劑對照，僅含菌液作空白對照，以阿莫西林作為陽性對照，同一板重復４次，共置于３７ ℃ ５％ ＣＯ２培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)１８ ｈ，以培養(yǎng)液透明為無菌生長的最低抑菌濃度（ＭＩＣ值）。

３）抑菌效果的測定。用酶標儀于４５０ ｎｍ波長處測定細菌的ＯＤ值，將９６孔板用蒸餾水清洗數(shù)遍，再用１％結晶紫染色１５ ｍｉｎ，用蒸餾水沖洗至透明后，加入２％的ＳＤ洗脫生物膜，再用酶標儀于６０５ ｎｍ波長處測試生物膜的ＯＤ值。抑菌率的計算方法如下：

抑菌率＝■×１００％

２ 結果與分析

２．１ 龍葵果不同極性提取物對變異鏈球菌的抑菌率

采用微孔板二倍稀釋法測定龍葵果不同極性的５種提取物對變異鏈球菌生長及其生物膜形成的抑制率，結果如表１、表２。由表１、表２可知，龍葵果乙醇和水提取物對變異鏈球菌的生長有一定抑制作用；乙酸乙酯、正丁醇、乙醇及水提取物對變異鏈球菌生物膜形成有一定抑制作用，濃度為５００.0 μｇ／ｍＬ時，乙醇及水提取物的抑制率分別為５０．３４％、５０．６８％。

２．２ 龍葵果不同極性提取物對大腸桿菌的抑菌率

采用微孔板二倍稀釋法測定龍葵果不同極性的５種提取物對大腸桿菌生長及其生物膜形成的抑制率，結果如表３、表４。由表３、表４可知，５種不同極性的提取物對大腸桿菌均無抑制作用，而氯仿、乙酸乙酯提取物對大腸桿菌生物膜形成有不同程度的抑制作用，濃度為１.0 ｍｇ／ｍＬ時，抑制率分別為８９．２４％、８０．２７％。

２．３ 不同提取物對受試菌的ＭＩＣ５０

依據(jù)ＭＩＣ５０的判斷標準，龍葵果乙醇提取物抑制變異鏈球菌生長的ＭＩＣ５０大于１.0 ｍｇ／ｍＬ，抑制其生物膜形成的ＭＩＣ５０為２５０.0 μｇ／ｍＬ；乙酸乙酯、正丁醇、乙醇及水提取物對變異鏈球菌生物膜形成有一定抑制作用，濃度為５００.0 μｇ／ｍＬ時，乙醇及水提取物的抑制率分別為５０．３４％、５０．６８％。氯仿提取物抑制大腸桿菌生物膜形成的ＭＩＣ５０約為５００.0 μｇ／ｍＬ，乙酸乙酯提取物的ＭＩＣ５０小于１.0 ｍｇ／ｍＬ。

結果表明，龍葵果乙醇提取物對變異鏈球菌的生長及其生物膜形成有一定的抑制作用；氯仿、乙酸乙酯提取物中含有抑制大腸桿菌生物膜形成的活性成分。

３ 討論

細菌生物膜是細菌的一種保護性生長模式，是細菌被包裹在自身分泌的多聚物中形成具高度分化結構的特殊細胞群體結構，能不斷地釋放浮游細菌引起持續(xù)性感染，對抗生素和宿主免疫防御機制的抗性很強，８０％的細菌性感染與其有關［７，８］，主要有由革蘭氏陽性球菌導致的齲齒，革蘭氏陰性厭氧性口腔細菌導致的牙菌斑，腸道細菌引起的膽囊感染，以及大腸桿菌和其他革蘭氏陰性菌引起的細菌性前列腺炎等［９］。從天然產(chǎn)物中篩選抑制細菌生物膜形成的活性成分已成為藥物的研發(fā)熱點。

龍葵在全國各地均有分布，在新疆南部有大量野生龍葵生長，龍葵全草均可入藥，有清熱、解毒、活血、消腫等功能，主治感冒、牙痛、慢性支氣管炎、痢疾、乳腺炎等?。积埧N子可治急性扁桃體炎、疔瘡等；龍葵果酸甜可口，可作為水果食用，同時也是極好的天然色素資源［１０］。龍葵資源豐富，多處于未開發(fā)的野生狀態(tài)，對其藥用價值的研究可促進該植物的合理開發(fā)利用，對其抑菌成分、機理以及對其他細菌的影響還有待于更進一步的研究。

對龍葵果的提取物進行抑菌篩選時發(fā)現(xiàn)，一些提取物對大腸桿菌沒有抑菌作用，反而有促進細菌生長的趨勢，龍葵果的果實為多肉漿果，含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等成分高，為細菌生長提供了營養(yǎng)成分［１１］。龍葵果不同極性提取物所含化學成分的類別和含量不同，使其抑菌活性不同，而同一提取物對不同菌種的抑制敏感性也存在差異。該研究可為龍葵果的藥用開發(fā)提供實驗依據(jù)，對龍葵果抑菌成分、機理及對其他細菌的影響還有待進一步研究。

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