１株絮凝劑高產(chǎn)菌的篩選及其培養(yǎng)條件優(yōu)化

摘要：從污水中篩選到１株新型高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌Ｎ－７， 根據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性初步鑒定為桿菌。該菌培養(yǎng)３２ ｈ進(jìn)入穩(wěn)定期，３６ ｈ時絮凝活性達(dá)到最大。通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)表明，菌株Ｎ－７最適培養(yǎng)基為初始ｐＨ ７．５、培養(yǎng)溫度３０ ℃、轉(zhuǎn)速１７０ ｒ／ｍｉｎ，在此條件下，所產(chǎn)絮凝劑對高嶺土懸液的絮凝率高達(dá) ９１．３％。

關(guān)鍵詞：菌株篩選；微生物絮凝劑；正交試驗(yàn)；優(yōu)化

中圖分類號：Ｘ７０３．５ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3715-04

Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ a Ｈｉｇｈ Ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｂａｃｔｅｒｉａ Stain ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ

Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ

ＷＡＮＧ Ｓｈｕｏ１，ＺＨＡＯ Ｙｉ－ｌｉｎｇ２，ＨＵＡＮＧ Ｄｅ－ｚｈｉ１，ＺＨＡＮＧ Ｃａｎ１，ＸＵＥ Ｙｏｎｇ－ｃｈａｎｇ１

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｄａｌｉａｎ Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｄａｌｉａｎ １１６０３４，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ｈｕａｙｉｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｍａｔｅｒｉａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１００３４，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｎｅｗ ｈｉｇｈ ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ strain Ｎ－７ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ． Ｉｔ ｗａｓ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ａ ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｔｓ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ and ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ． Ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｒｅａｃｈｅｄ ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ ｐｈａｓｅ ａｆｔｅｒ been cultured for ３２ ｈ， ａｎｄ ｈａｄ the ｍａｘｉｍｕｍ flｏｃｃｕｌａｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｆｔｅｒ ３６ ｈ． According to ｓｉｎｇｌｅ－ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ， ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｆｌｏｃｃｕｌａｎｔｓ－ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ７．５， ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ３０ ℃， ｒｏｔａｔｉｏｎ ｓｐｅｅｄ １７０ ｒ／ｍｉｎ. Tｈｅ ｆｌｏｃｃｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｋａｏｌｉｎ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ to ９１．３％ under the optimized conditions．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： strain ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｂｉｏｆｌｏｃｃｕｌａｎｔ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

絮凝劑是一種可使液體中不易沉降的固體懸浮顆粒凝聚沉降的物質(zhì)。傳統(tǒng)的絮凝劑按照其化學(xué)成分可分為無機(jī)絮凝劑和有機(jī)絮凝劑兩類。其中無機(jī)絮凝劑是指利用鐵、鋁等金屬離子沉降液體中不易沉降的固體懸浮顆粒，有機(jī)絮凝劑主要是指聚丙烯酰胺等一些具有高絮凝性的有機(jī)試劑［１－３］。傳統(tǒng)的絮凝劑由于成本低而被廣泛應(yīng)用，但傳統(tǒng)的絮凝劑存在二次污染現(xiàn)象，對人類身體健康和自然環(huán)境有潛在危害。因此，開發(fā)高效、無毒、無二次污染的新型絮凝劑具有重要的意義［４］。

微生物絮凝劑是一類由微生物或其分泌物產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其絮凝范圍廣、絮凝活性高，作用條件粗放，可以廣泛應(yīng)用于污水和工農(nóng)業(yè)廢水處理中。由于其具有高效、安全、不污染環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品加工、生物產(chǎn)品分離等領(lǐng)域也有巨大的潛在應(yīng)用價值［５－10］。由于微生物絮凝劑可以克服傳統(tǒng)絮凝劑的缺陷，最終實(shí)現(xiàn)無污染排放，因此微生物絮凝劑的研究正成為當(dāng)今世界絮凝劑方面研究的重要課題。此前，國內(nèi)外學(xué)者分離篩選出的產(chǎn)微生物絮凝劑的菌株有幾十種。國外對于微生物絮凝劑的應(yīng)用部分已處于工業(yè)化，由于微生物絮凝劑成本較高、絮凝活性低，目前我國尚未廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中，本試驗(yàn)從污水中篩選得到１株具有高效絮凝作用的菌株，通過對其絮凝條件的優(yōu)化，以期為工業(yè)化應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 材料

１．１．１ 菌株來源 試驗(yàn)菌株分離自沈陽仙女河污水處理廠以及沈陽西部污水處理中心收集的污水樣品。

１．１．２ 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏１號培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、ＰＤＡ培養(yǎng)基。

１．１．３ 菌株分離 將污水充分振蕩后，吸?。?ｍＬ懸濁液，加入到裝有５０ ｍＬ培養(yǎng)基的三角瓶中，１６０ ｒ／ｍｉｎ、 ２８ ℃的條件下振蕩培養(yǎng)２４ ｈ后取出，用去離子水將懸濁液稀釋成濃度梯度為１０－１～１０－５的懸濁液。分別吸?。埃埃?ｍＬ 懸液涂在篩選培養(yǎng)基平板上。２８ ℃培養(yǎng)２～５ ｄ，用平板劃線的方法反復(fù)劃線，得到單一菌株。

１．１．４ 模擬污水的制備 以菌株對高嶺土懸濁液的絮凝效果作為菌株是否具有絮凝作用的判斷依據(jù)。用化學(xué)純高嶺土和去離子水制成的４ ｇ/Ｌ懸濁液作為模擬污水。

１．２ 方法

１．２．１ 菌株富集培養(yǎng)與初篩 在２５０ ｍＬ三角瓶中加入５０ ｍＬ液體培養(yǎng)基，挑取篩選培養(yǎng)基上的單一菌株接種于液體培養(yǎng)基中，１６０ ｒ／ｍｉｎ、２８ ℃振蕩培養(yǎng)２４ ｈ。采用高嶺土懸濁液測試培養(yǎng)液的絮凝活性。篩選出絮凝活性較高的菌株。

１．２．２ 菌株復(fù)篩 將初篩獲得的有較高絮凝活性的菌株用平板劃線法進(jìn)行純化分離，２８ ℃恒溫培養(yǎng)１～２ ｄ，觀察菌落生長情況。待充分生長后選單個菌落接種于裝有５０ ｍＬ培養(yǎng)基的２５０ ｍＬ錐形瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)４８ ｈ，培養(yǎng)條件同初篩。試驗(yàn)重復(fù)３次，篩選出絮凝率較為穩(wěn)定的菌株作為本試驗(yàn)后續(xù)研究的出發(fā)菌株。

１．２．３ 絮凝活性測定 以高嶺土懸浮液模擬實(shí)際廢水，取濃度為０．４％的高嶺土懸液１００ ｍＬ于２５０ ｍＬ三角瓶中，同時加入２ ｍＬ經(jīng)培養(yǎng)２４ ｈ的菌液及５ ｍＬ ＣａＣｌ２溶液，以只加５ ｍＬ ＣａＣｌ２溶液、不加菌液的高嶺土懸液作為對照，三角瓶充分振蕩２ ｍｉｎ，靜置８ ｍｉｎ，用移液槍吸取上清液，測定其在５５０ ｎｍ處的吸光度。通過公式（１）計算出絮凝率［１１－１４］。

η=■×１００％ （１）

式中：A為對照上清液５５０ ｎｍ處的吸光度；Ｂ為樣品上清液５５０ ｎｍ處的吸光度。

１．２．４ 絮凝條件的優(yōu)化研究 培養(yǎng)條件的優(yōu)化：以篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)，通過分別改變培養(yǎng)基的初始ｐＨ、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)和培養(yǎng)時間等條件測定發(fā)酵液對高嶺土懸液的絮凝率，確定該菌種的最佳培養(yǎng)條件。試驗(yàn)初始ｐＨ分別設(shè)為６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０，進(jìn)行了３次平行試驗(yàn)；對培養(yǎng)溫度分別設(shè)為２４、２６、２８、３０、３２、３４ ℃，進(jìn)行了３次平行試驗(yàn)；對搖床轉(zhuǎn)速分別為１４０、１５０、１６０、１７０、１８０ ｒ／ｍｉｎ進(jìn)行了３次平行試驗(yàn)。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選結(jié)果

試驗(yàn)從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上分離得到１３株菌，編號分別為Ｎ－１，Ｎ－２，……，Ｎ－１３；從高氏１號培養(yǎng)基上分離得到７株菌，編號分別為Ｇ－１，Ｇ－２，……，Ｇ－７；從麥芽汁培養(yǎng)基上分離得到４株菌，編號分別為Ｍ－１，Ｍ－２，Ｍ－３，Ｍ－４；從查氏培養(yǎng)基上分離得到２１株菌，編號分別為Ｃ－１，Ｃ－２，……，Ｃ－２１，從ＰＤＡ培養(yǎng)基上分離得到２株菌，編號分別為Ｐ－１，Ｐ－２。上述菌株經(jīng)初篩后得到１８株具有絮凝作用的菌株。經(jīng)過復(fù)篩后得到６株絮凝率超過５０％的菌株，分別為Ｎ－６，Ｎ－７，Ｎ－１３，Ｃ－４，Ｃ－１５，Ｃ－１９。以上６株菌通過反復(fù)接種傳代３次后，菌株Ｎ－７的絮凝效果最穩(wěn)定，因此本研究選?。危纷鳛楹罄m(xù)試驗(yàn)菌株。

２．２ N-7菌落形態(tài)

菌株Ｎ－７在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成橘黃色半透明菌落（圖１），表面光滑、黏稠，單菌落直徑０．４～０．６ ｍｍ。生理生化試驗(yàn)表明，革蘭氏染色陰性，無芽孢，接觸酶試驗(yàn)陽性，甲基紅試驗(yàn)陰性，Ｖ－Ｐ試驗(yàn)陰性，發(fā)酵產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，輕微水解淀粉，明膠液化試驗(yàn)陰性。

２．３ 單因素試驗(yàn)結(jié)果

２．３．１ 培養(yǎng)時間 將１ ｍＬ菌種液接于ｐＨ ７．０的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于３０ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床中培養(yǎng)，試驗(yàn)從第３０小時起，每２ ｈ取樣進(jìn)行絮凝率測定，共取７個時間點(diǎn)，結(jié)果如圖２所示。由圖２可知，絮凝率隨著培養(yǎng)時間的增加呈先升高再緩慢下降的趨勢，在３６ ｈ處達(dá)到最高點(diǎn)８９．０％，隨后出現(xiàn)緩慢下降趨勢，結(jié)合菌體生長曲線可知，菌體在３２ ｈ后開始進(jìn)入穩(wěn)定期，３６ ｈ時菌體數(shù)量和活性基本穩(wěn)定，表明菌體此時產(chǎn)生微生物絮凝劑的效果最佳，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌體出現(xiàn)老化現(xiàn)象，菌體活性隨之下降，菌體的絮凝效果也逐漸降低，因此本試驗(yàn)確定培養(yǎng)時間為３６ ｈ。

２．３．２ 培養(yǎng)基初始ｐＨ 制備Ｎ－７菌株種子液，?。?ｍＬ種子液分別接種于初始ｐＨ為６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０的發(fā)酵培養(yǎng)基，３０ ℃、１６０ ｒ／ｍｉｎ搖床培養(yǎng)３６ ｈ，取發(fā)酵培養(yǎng)基的菌懸液２ ｍＬ加入到高嶺土懸濁液中，充分振蕩后靜置８ ｍｉｎ，在５５０ ｎｍ的條件下測吸光值，進(jìn)行３次平行試驗(yàn)，結(jié)果如圖３所示。由圖３可知，培養(yǎng)基初始ｐＨ對菌體的絮凝效果有直接的影響，絮凝率呈先逐漸增加后緩慢下降的趨勢，在ｐＨ為７．５時最大，達(dá)到８１．２％。因此菌體絮凝率達(dá)到最高的培養(yǎng)基的初始ｐＨ為７．５。

２．３．３ 培養(yǎng)溫度 取１ ｍＬ Ｎ－７菌株的種子液分別接種于６瓶初始ｐＨ ７．５的發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度分別設(shè)置為２４、２６、２８、３０、３２、３４ ℃，在轉(zhuǎn)速為１６０ ｒ／ｍｉｎ的搖床培養(yǎng)３６ ｈ，取發(fā)酵培養(yǎng)基的菌懸液２ ｍＬ加入到高嶺土懸濁液中，充分振蕩后靜置８ ｍｉｎ，在５５０ ｎｍ的條件下測吸光值，進(jìn)行３次平行試驗(yàn)，結(jié)果如圖４所示。由圖４可知，培養(yǎng)溫度對菌體的絮凝性也有較大的影響，絮凝率在２４～２８℃之間逐漸升高，從６９．５％升高到８７．３％；隨后開始下降，因此最佳培養(yǎng)溫度定為２８ ℃。

２．３．４ 培養(yǎng)轉(zhuǎn)速 ?。?ｍＬ Ｎ－７菌株的種子液分別接種于５瓶初始ｐＨ ７．５的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于２８ ℃、轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為１４０、１５０、１６０、１７０、１８０ ｒ／ｍｉｎ，振蕩培養(yǎng)３６ ｈ。取發(fā)酵培養(yǎng)基的菌懸液２ ｍＬ加入到高嶺土懸濁液中，充分振蕩后靜置８ ｍｉｎ，在５５０ ｎｍ的條件下測吸光值，進(jìn)行３次平行試驗(yàn)，結(jié)果如圖５所示。由圖５可知，轉(zhuǎn)速的高低直接影響到菌體的生長繁殖以及代謝物的分泌，因此對絮凝率的影響也很關(guān)鍵，隨著培養(yǎng)轉(zhuǎn)速的不斷增加，絮凝率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在轉(zhuǎn)速為１６０ ｒ／ｍｉｎ時達(dá)到最高點(diǎn)（８７．２％），所以最佳培養(yǎng)轉(zhuǎn)速定為１６０ ｒ／ｍｉｎ。

２．４ 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌體絮凝性的大小為考察指標(biāo)，采用Ｌ９（４３）正交表，進(jìn)行４因素３水平的正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表１。由表１可知，４個因素對絮凝率影響大小依次為Ｃ、Ｄ、Ｂ、Ａ，即培養(yǎng)溫度的影響最大；結(jié)合k值可知，優(yōu)化提取工藝是Ｃ３Ｄ３Ｂ２Ａ２，即培養(yǎng)時間為３６ ｈ、初始ｐＨ為７．５、培養(yǎng)溫度為３０ ℃、培養(yǎng)轉(zhuǎn)速為１７０ ｒ／ｍｉｎ。按Ｃ３Ｄ３Ｂ２Ａ２進(jìn)行３次平行試驗(yàn)，測得平均絮凝率為９１．３％，高于正交試驗(yàn)結(jié)果的最大值，因此認(rèn)為正交試驗(yàn)得出的最優(yōu)水平是可靠的。

３ 結(jié)論

從污水中篩選得到的新型高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌株Ｎ－７，經(jīng)過正交試驗(yàn)優(yōu)化得出其培養(yǎng)基在初始ｐＨ為７．５、培養(yǎng)溫度３０ ℃、搖床轉(zhuǎn)速１７０ ｒ／ｍｉｎ、培養(yǎng)３６ ｈ時所產(chǎn)絮凝劑對高嶺土懸液的絮凝率高達(dá)９１．３％。本試驗(yàn)菌株來自污水中，培養(yǎng)基成本低、易篩選，并且通過對絮凝條件的優(yōu)化，絮凝效果較好，可以對工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的污水處理及環(huán)境保護(hù)起到一定的積極作用。

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