ＳＳＲ鑒定水稻兩系雜交種純度的運(yùn)用與探討Ⅱ．不同苗齡取樣方法對室內(nèi)純度結(jié)果的影響

摘要：以水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）兩優(yōu)１７為試驗材料進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽后，對幼苗進(jìn)行大苗、小苗分類，并利用ＳＳＲ引物分別對其進(jìn)行室內(nèi)純度鑒定。鑒定結(jié)果表明，苗的大小對鑒定結(jié)果的影響較大，小苗與大苗的純度相差２．８個百分點(diǎn)，超出了允許的誤差范圍。與大田相比，大苗的純度更接近于田間秧苗純度。在田間小苗往往不能成苗，不影響大田純度，故小苗是造成室內(nèi)與大田純度鑒定結(jié)果產(chǎn)生差異的重要原因之一。

關(guān)鍵詞：水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）；ＳＳＲ；室內(nèi)；田間；純度鑒定

中圖分類號：Ｑ７８９；Ｓ５１１ 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）17－3687-02

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｅｅｄ Ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ Ｔｗｏ－ｌｉｎｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｒｉｃｅ ｂｙ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔ （ＳＳＲ）Ⅱ．Effects of Sampling Methods on Laboratory Purity Detection

ＬＩＡＯ Ｆａｎｇ-ｌｉ1，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ-ｆｅｉ1，ＬＩＮ Meｉ1，ＺＨＡＯ Ｈｏｎｇ1，ＸＩＯＮＧ Ｘｉａｎ-ｆｅｎｇ1，ＴＵ Ｓｈｕ-ｘｉｎ2，ＺＨＡＮＧ Ｋａｉ3

（１．Ｓｅｅｄ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｂｕｒｅａｕ ｏｆ Ｊｉｎｇｚｈｏｕ， Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２０，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ； 2．Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ；

3． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Ｈｕｂｅｉ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｏｆ Ｌｉａｎｇｙｏｕ１７ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｓｔａｎｄａｒｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ａｓ ｌａｒｇｅ or ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ． Ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｅｅｄ ｐｕｒｉｔｙ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ＳＳＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｕｒｉｔｙ ａｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｌａｒｇｅ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ 2．8％， ｗｈｉｃｈ ｅｘｃｅｅｄ ｔｈｅ ａｌｌｏｗａｂｌｅ ｅｒｒｏｒ ｒａｎｇｅ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｆｉｅｌｄ． Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ， ｔｈｅ ｓｍａｌｌ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｈａｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｆｉｅｌｄ ａｓ ｔｈｅｙ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｍａｔｕｒｅ ｔｈｕｓ ｗａｓ ｔｈｅ ｋｅｙ ｆａｃｔｏｒ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ ｔｏ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｅｅｄｓ ｐｕｒｉｔｙ ｉｎ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ ｆｉｅｌｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｒｉｃｅ（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）； ＳＳＲ； ｉｎｄｏｏｒ， ｆｉｅｌｄ； ｐｕｒｉｔｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

水稻（Ｏｒｙｚａ ｓaｔｉｖａ Ｌ．）的種子發(fā)芽率和成秧率是兩個概念，前者表示在規(guī)定條件和時間內(nèi)長成的正常幼苗占供檢種子數(shù)的百分率，后者表示百個芽苗大田形成正常植株的株數(shù)。前人用ＳＳＲ標(biāo)記檢測種子純度時，用于提取ＤＮＡ的材料大多來自兩個途徑［１-１０］，一是在田間植株上直接剪取葉片，二是在發(fā)芽箱內(nèi)培養(yǎng)幼苗。第一種方法由于省去了種子樣品發(fā)芽、成秧等環(huán)節(jié)，其結(jié)果與原樣品實際純度有所差異；第二種方法由于發(fā)芽箱條件往往設(shè)定為種子的最適發(fā)芽環(huán)境，很多在田間不能成苗的種子在室內(nèi)可以長成弱苗或殘苗，在取樣時，根據(jù)操作規(guī)程，這類小苗都被當(dāng)成鑒定對象進(jìn)行了檢測。這一批在大田有可能不能成秧的幼苗是否會影響到室內(nèi)鑒定結(jié)果與大田生產(chǎn)中實際純度的吻合性，目前尚未見報道。本試驗?zāi)M田間成秧率取樣，探索ＤＮＡ模板制備前，按室內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽方法獲得的大苗、小苗對種子純度鑒定結(jié)果的影響，從而尋求減少或修正利用ＳＳＲ引物鑒定室內(nèi)與田間純度之間誤差的途徑。

１ 材料與方法

１．１ 材料

所用雜交水稻品種兩優(yōu)１７及其親本均由湖北省種子管理局統(tǒng)一提供。

所用引物及試劑均由北京鼎國生物有限公司提供。

１．２ ＰＣＲ反應(yīng)體系

ＰＣＲ擴(kuò)增反應(yīng)總體積１０ μＬ ：１０×ｂｕｆｆｅｒ １ μＬ，１０ ｍmol/L ｄＮＴＰ ０．２ μＬ，５０ ｎｇ／μＬ ｐｒｉｍｅｒ ０．２ μＬ＋０．２ μＬ，２ U／μＬ Ｔａｑ酶 ０．６ μＬ，２５ ｎｇ／μＬ ＤＮＡ １ μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ６．８ μＬ。ＰＣＲ擴(kuò)增程序：９４℃預(yù)變性４ ｍｉｎ； ９４ ℃變性１５ ｓ，５５ ℃退火１５ ｓ，７２ ℃延伸３０ ｓ，３５個循環(huán)；７２ ℃下延伸７ ｍｉｎ。擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為３％、含ＥＢ的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳后應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

１．３ ＤＮＡ模板制備和引物篩選

ＤＮＡ模板的制備采用農(nóng)業(yè)部推薦的簡易提?。模危练?。采用１０個單株幼苗抽提的ＤＮＡ混合物做模板，以消除雜株可能對篩選結(jié)果的干擾，然后用農(nóng)業(yè)部推薦的４４對兩系雜交種常用ＳＳＲ引物分別對兩優(yōu)１７及其父母本ＤＮＡ進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在含EB的３％的瓊脂糖凝膠電泳后成像觀察。從中篩選出多態(tài)性高、共顯性強(qiáng)、譜帶清晰、雜株檢出率高的引物ＲＭ２１鑒定兩優(yōu)１７。

１．４ 室內(nèi)大苗和小苗的分類及純度鑒定

從兩優(yōu)１７中隨機(jī)抽?。梗埃傲７N子，按ＧＢ／Ｔ ３５４３．４—１９９５進(jìn)行發(fā)芽試驗。發(fā)芽兩周后按苗高分成兩類：小苗≤３ ｃｍ，大苗＞３ ｃｍ。將這兩類苗分別用ＲＭ２１引物進(jìn)行純度鑒定。

１．５ 樣品的田間純度鑒定

從ＳＳＲ法室內(nèi)檢測的同一份樣品中隨機(jī)抽出部分種子進(jìn)行田間正季純度鑒定。種植成５００株的小區(qū)，共５０行，每行１０株，株距１７ ｃｍ，行距２７ ｃｍ。在小區(qū)前端種植該樣品的不育系和恢復(fù)系親本各兩行（２０株），作為田間雜株比對標(biāo)樣。鑒定方法根據(jù)農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程真實性和品種純度鑒定標(biāo)準(zhǔn)（ＧＢ／Ｔ ３５４３．５—１９９５）執(zhí)行。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 室內(nèi)樣品純度鑒定結(jié)果

從兩優(yōu)１７中隨機(jī)抽取的９００粒種子中有７４５粒發(fā)芽，發(fā)芽率為８２．８％，將這兩類苗用SSR引物ＲＭ２１進(jìn)行純度鑒定。室內(nèi)檢測結(jié)果表明（表１），７４５個芽苗中，小苗１９１株，占總苗數(shù)２５．６％，其中檢出雜株３１株，小苗雜株率１６．２％，純度８３．８％；大苗５５４株，占總苗數(shù)７４．４％，其中檢出雜株７４株，大苗雜株率１３．４％，純度８６．６％。

２．２ 田間正季鑒定結(jié)果

田間鑒定與室內(nèi)發(fā)芽所用的種子為同一份樣品。５００株中有雜株４８株，其中不育系９株，恢復(fù)系３株，其他異形株３６株，雜株率９．６％，純度９０．４％（表1）。

２．３ 室內(nèi)與田間樣品純度鑒定結(jié)果比較

樣品田間正季純度鑒定結(jié)果比室內(nèi)樣品的總體純度高４．５個百分點(diǎn)，比大苗的純度高出３．８個百分點(diǎn)，比小苗的純度高出６．６個百分點(diǎn)。室內(nèi)ＳＳＲ鑒定中去掉小苗后，樣品的總體純度提高０．７個百分點(diǎn)，純度值上升０．８％。大苗純度鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果吻合度最高。

３ 小結(jié)與討論

結(jié)果表明，室內(nèi)檢測取樣的幼苗大小對純度鑒定結(jié)果有明顯的影響。而在大田條件下，種子存在成秧率的問題，室內(nèi)的弱苗、殘苗在大田中不能正常成秧，因此對大田純度不構(gòu)成影響。按目前通用的單個引物檢測種子純度的操作規(guī)程，是將樣品中無論大苗、小苗均全部取樣進(jìn)行檢測，并用這個純度結(jié)果去代表大田生產(chǎn)的質(zhì)量狀況。這個結(jié)果是種子的分子生物學(xué)純度，實際上是一個微觀理論值，而種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定判斷種子質(zhì)量優(yōu)劣的依據(jù)則是大田生產(chǎn)表現(xiàn)的植物形態(tài)學(xué)純度，是一個宏觀現(xiàn)實的數(shù)值。實際操作中將這類不能成秧的弱苗也納入檢測，使得室內(nèi)檢測結(jié)果與大田種植結(jié)果之間存在一定的偏差。由于不同樣品中混雜的雜株類型不同，生活力也會不同，這種偏差對ＳＳＲ引物檢出純度的影響不同。因此，在室內(nèi)鑒定時，如何取樣才能消除取樣誤差，使室內(nèi)純度鑒定結(jié)果更能反映大田生產(chǎn)的真實純度，建議在進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)上，將明顯不能成秧的小苗或弱苗剔出檢測群體。

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