促甲狀腺激素(TSH)檢測(cè)方法小析

摘 要:促甲狀腺激素(Thyroid stimulating hormone，thyrotropin，TSH)由腦垂體前葉的嗜堿性細(xì)胞分泌，以游離的形式存在于血液中，含量很低，性質(zhì)穩(wěn)定的一種糖蛋白激素。主要生理功能是促進(jìn)甲狀腺的發(fā)育和分泌，從而影響全身的代謝。鑒于TSH檢測(cè)結(jié)果的重要臨床意義，其檢測(cè)方法有很多，主要有放射免疫分析，免疫放射分析等。隨著生物、化學(xué)以及材料等學(xué)科的發(fā)展，科學(xué)家們正在努力尋求更準(zhǔn)確、更便捷、低成本的檢測(cè)方法，為內(nèi)分泌疾病的臨床診斷提供快速、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞:促甲狀腺激素(Thyroid stimulating hormone，thyrotropin，TSH) 放射免疫分析 TSH檢測(cè)方法

中圖分類號(hào):R446文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):1674-098X(2012)07(a)-0004-03

促甲狀腺激素(Thyroid stimulating hormone，thyrotropin，TSH)由腦垂體前葉的嗜堿性細(xì)胞分泌，以游離的形式存在于血液中，含量很低，性質(zhì)穩(wěn)定的一種糖蛋白激素。其相對(duì)分子量為25～28kDa。與促卵泡刺激激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)、促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)以及人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)一樣均為異源二聚體糖蛋白激素，由非特異的α亞基和特異性β亞基以非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)而成[1，2]。主要生理功能是促進(jìn)甲狀腺的發(fā)育和分泌，從而影響全身的代謝。

TSH是受下丘腦-腦垂體-甲狀腺這一條軸線控制的，下丘腦是最高層，分泌的促甲狀腺激素釋放激素(Thyroid-stimulating hormone releasing hormone，TRH)而甲狀腺是最底層，釋放的是甲狀腺素，腦垂體前葉居于中間，上受到下丘腦分泌的TRH調(diào)控，下有受到甲狀腺分泌的甲狀腺激素(T3，T4)的反饋調(diào)節(jié)。當(dāng)甲狀腺功能發(fā)生改變時(shí)，TSH水平呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)。甲狀腺機(jī)能低下者多表現(xiàn)為血液中的TSH水平增高，甲狀腺功能亢進(jìn)以及垂體機(jī)能減退者多表現(xiàn)為TSH的降低，同時(shí)TSH水平的高低也是檢測(cè)新生兒先天性甲狀腺機(jī)能減退的指標(biāo)。1995年，美國國家臨床生物化學(xué)家協(xié)會(huì) (US National association of clinical biochemists，NACB)提出了將TSH 作為甲狀腺功能的一線測(cè)試項(xiàng)目(First-line Test)。即在甲狀腺功能檢測(cè)中，先考慮TSH的測(cè)試結(jié)果，再結(jié)合其余甲狀腺激素的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行疾病的診斷，并且通過TSH的精確測(cè)定能排除眾多非甲狀腺疾病的干擾。

鑒于TSH檢測(cè)結(jié)果的重要臨床意義，其檢測(cè)方法有很多，主要有放射免疫分析，免疫放射分析，酶聯(lián)免疫吸附，時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定技術(shù)，電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光免疫分析以及一些生物發(fā)光檢測(cè)[3，4]、顆粒凝集檢測(cè)法[5，6]等。

放射免疫分析法(Radioimmunoassay，RIA)是促甲狀腺激素的較早期檢測(cè)方法。該法使用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式，標(biāo)記TSH抗原與樣本或標(biāo)準(zhǔn)品內(nèi)抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體，實(shí)現(xiàn)定量。放射免疫分析靈敏度不夠，無法區(qū)分部分正常人的TSH水平，且操作時(shí)間很長，干擾因素多、放射性元素的抗原標(biāo)記物穩(wěn)定性欠佳，故其應(yīng)用受到一定的限制[7]。免疫放射分析(immunoradiom-eric assay，IRMA)在RIA基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，該方法使用過量標(biāo)記抗體，采用雙抗體夾心的免疫反應(yīng)模式。一方面保證抗體與待測(cè)標(biāo)本中的抗原充分反應(yīng)，縮短反應(yīng)時(shí)間，一定程度上提高了靈敏度;另一方面，標(biāo)記的是免疫球蛋白，標(biāo)記試劑相對(duì)穩(wěn)定。但其仍無法避免方法的放射性元素的污染[8～12]。

繼放射免疫分析后出現(xiàn)的TSH酶聯(lián)免疫吸附法(Immunoenzymetric assay，IEMA)或稱之為酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)以酶作為標(biāo)記物，使用非競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式，通過酶催化底物顯色。Tseng 等使用堿性磷酸酶作為抗體的標(biāo)記物，用抗-TSH多抗包被96-孔酶標(biāo)板，利用堿性磷酸酶對(duì)底物對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate，p-NPP)作用，生成黃色對(duì)硝基苯酚在405nm處產(chǎn)生吸收，實(shí)現(xiàn)對(duì)TSH的檢測(cè)。該法雖避免放射性元素的污染，較RIA反應(yīng)時(shí)間有所縮短，但由于使用分光光度法檢測(cè)，靈敏度欠佳[13，14]。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，可以獲得識(shí)別兩種抗原(TSH和堿性磷酸酶)的雙特異抗體。Morimoto等通過該雙特異抗體的F(ab’)片段包被固相，酶通過免疫反應(yīng)與標(biāo)記抗體相聯(lián)，極大減小了蛋白的干擾，使得檢測(cè)靈敏度得到一定的提高[15]。

八十年代發(fā)展的時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定技術(shù)(Time resolve immunofluorometric assay，TRIFMA)具有量子產(chǎn)率高，stoke’s位移大，發(fā)射峰窄等優(yōu)點(diǎn)。它屬于超微量免疫分析技術(shù)。該技術(shù)使用鑭系元素[16，17]為示蹤劑代替放射性同位素，用具有雙功能基團(tuán)的鑭系元素來標(biāo)記抗原或抗體，當(dāng)解離下來的鑭系元素與特制的擴(kuò)增液形成新的螯合物時(shí)，其熒光明顯增強(qiáng)而持久。90年代，Papanastasion Diamandi等[18]通過生物素-親和素作用力將堿性磷酸酶與抗體相連接，堿性磷酸酶作用于底物，5-氟水楊酸磷酸酯(5-fluorosalicyl phosphate，5-FSAP)，生成產(chǎn)物5-氟水楊酸(5-fluorosalicylic acid，5-FSA)。加入鋱(Tb3+)-乙二胺四乙酸(EDTA)螯合物后形成熒光壽命長三元復(fù)合物FSA-Tb3+-EDTA。為了滿足臨床快速檢測(cè)，Ylikotila等[19]通過生物素-親和素之間的作用，將特異性優(yōu)異的生物素化重組Fab’片段與固相上的親和素作用，減小抗體的表面積(至一斑點(diǎn)大小)，利用高靈敏的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)，效果良好。

TSH的電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中，常用的體系為三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2+-三丙胺氨系統(tǒng)[20]。加拿大的Elecsyst 2010免疫分析[21，22]使用鏈親和素包被的磁性微粒子，通過親和素與生物素化抗體的相互作用，實(shí)現(xiàn)結(jié)合物與游離物質(zhì)的分離。

化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)按照標(biāo)記方法的不同分為化學(xué)發(fā)光金標(biāo)記免疫分析法和以酶標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法將發(fā)光物質(zhì)如吖啶酯類化合物(如吖啶酯[23～28]，吖啶鹽的琥珀酰亞胺衍生物(N-Succinimidyl derivative of an acridium salt)[29]，異魯米諾等直接標(biāo)記在抗原或抗體上的化學(xué)發(fā)光免疫分析法，因發(fā)光時(shí)間短，需要高精度自動(dòng)分析系統(tǒng)。

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析，以酶標(biāo)記TSH抗原或抗體，進(jìn)行免疫反應(yīng)，與免疫反應(yīng)復(fù)合物結(jié)合的酶作用于發(fā)光底物，用發(fā)光信號(hào)測(cè)定儀進(jìn)行發(fā)光測(cè)定。常用的酶標(biāo)記物為堿性磷酸酶[30]和辣根過氧化物酶[31，32]。隨著，發(fā)光體系的增強(qiáng)劑的使用，該酶促化學(xué)發(fā)光時(shí)間得到延長。但該法檢測(cè)靈敏度仍需進(jìn)一步提高。

綜上所述，隨著生物、化學(xué)以及材料等學(xué)科的發(fā)展，針對(duì)TSH激素在檢測(cè)方面的研究一直沒有停止，科學(xué)家們正在努力尋求更準(zhǔn)確、更便捷、低成本的檢測(cè)方法，為內(nèi)分泌疾病的臨床診斷提供快速、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

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