枸杞多糖對(duì)老齡小鼠急性毒性研究

嚴(yán)子祎

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

枸杞多糖對(duì)老齡小鼠急性毒性研究

嚴(yán)子祎

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

研究枸杞（Lycium barbarum.）多糖對(duì)老齡小鼠的急性毒性反應(yīng)。對(duì)老齡模型小鼠采取一日內(nèi)最大耐受量實(shí)驗(yàn)。在試驗(yàn)前禁食（不禁水）12 h，然后進(jìn)行小鼠急性經(jīng)口毒理試驗(yàn)，每日采用最大濃度、最大體積、一次性灌胃給藥，連續(xù)觀察7 d，記錄小鼠的行為、攝食量、體重、糞便和死亡情況，研究枸杞多糖對(duì)老齡小鼠的安全性評(píng)價(jià)。對(duì)老齡模型小鼠以最大劑量、最大體積口服灌胃LBP，小鼠毛色、攝食量、體重和糞便情況均無明顯異常。小鼠肝臟、脾臟病理切片及血象結(jié)果顯示無明顯異常。枸杞多糖對(duì)老齡小鼠無急性毒性反應(yīng)。

枸杞多糖；急性毒性；D-半乳糖；安全性

枸杞為茄科Solanaceae枸杞屬落葉灌木植物，是我國(guó)名貴傳統(tǒng)中藥材，本屬約有80多種[1]，我國(guó)有7個(gè)種和2個(gè)變種[2]，主要盛產(chǎn)于我國(guó)西北的一些省區(qū)。枸杞子除了是傳統(tǒng)中藥材外還是一種保健食品[3]。其中，寧夏枸杞（Lycium barbarum.）分布最為廣泛，同時(shí)是唯一被載入《中國(guó)藥典》的枸杞物種[4]，其味甘、性平[5]，能滋補(bǔ)肝腎、益精明目，用于腰膝酸痛、虛勞精虧、內(nèi)熱消渴、眩暈耳鳴、血虛萎黃、目昏[6]，《神農(nóng)本草經(jīng)》中記載枸杞久服可堅(jiān)筋骨，用作強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥[7]。枸杞的主要成分是枸杞多糖、氨基酸、微量元素、維生素、?；撬帷⑸飰A、揮發(fā)油等[8]。枸杞多糖是由枸杞子經(jīng)水提取，乙醇沉淀等步驟后獲得的蛋白多糖[9]，近代許多研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖具有清除自由基，提高抗氧化酶活性，抑制脂質(zhì)的過氧化和保護(hù)生物膜等作用[10]，有助于提高身體的免疫力并且可以增強(qiáng)癌癥的治療效果[11]，還具有抗脂肪肝、降血脂、抗衰老等作用。枸杞是一味在中藥方劑中廣泛應(yīng)用的具有視神經(jīng)保護(hù)作用的中藥[12]。因此，將其作為功能因子來開發(fā)和研制相關(guān)的保健食品具有廣闊的發(fā)展前景。

隨著人民生活水平的日益提高，各種藥食同源的中藥材的急性毒性以及有無致畸致癌的作用越來越受到人們的關(guān)注。急性毒性實(shí)驗(yàn)是指動(dòng)物一日內(nèi)單次或多次給藥后，連續(xù)觀察動(dòng)物所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)以及死亡的情況[13]。急性毒性實(shí)驗(yàn)（單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)）是檢測(cè)新藥對(duì)人體毒性強(qiáng)弱的一種手段，并且可以為生殖毒性實(shí)驗(yàn)、長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)、致突變實(shí)驗(yàn)等設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)提供劑量選擇依據(jù)和相關(guān)信息，所以，急性毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)新藥的研發(fā)和應(yīng)用是非常有必要的研究[14]。

1 材料與儀器

1.1 材料

枸杞子（哈藥集團(tuán)世一堂制藥廠），清潔級(jí)雌性小鼠（長(zhǎng)春醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），小鼠飼料（江蘇協(xié)通生物工程有限責(zé)任公司，批號(hào)：20141113）。

1.2 試劑

D-半乳糖、福爾馬林固定液、固態(tài)石蠟、蘇木精-伊紅（H.E）、75%酒精、100%酒精、二甲苯。

1.3 儀器

電磁爐（中山市楓葉電器有限公司生產(chǎn)），超凈工作臺(tái)（長(zhǎng)沙凈化工程公司），抗凝血細(xì)胞分析儀（濟(jì)南格利特科技有限公司），超聲提取器（蘇州富怡達(dá)超聲波有限公司），低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），中藥材打粉機(jī)（江陰市寶利機(jī)械制造有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

2.1 枸杞多糖的制備

枸杞子于60℃恒溫箱內(nèi)干燥24 h后粉碎成粉末。以2 400 Hz超聲提取25 min，80℃低溫煎煮一個(gè)半小時(shí)后過濾，加入1 600 mL的水煮沸，再煎煮一個(gè)小時(shí)，再過濾，加入1 000 mL水煮沸后煎煮半小時(shí)，最后將所得濾液合并濃縮至260 mL。向濃縮液加入四倍體積量的95%酒精，靜置過夜沉淀，而后用離心機(jī)3 000 r離心20 min，棄去上清液，得到沉淀。12 h后離心。沉淀物依次用95%的乙醇、無水乙醇洗滌后，經(jīng)過真空干燥后得到枸杞多糖。加適量生理鹽水充分溶解后，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 老齡小鼠模型制備

實(shí)驗(yàn)采用20只4 w的實(shí)驗(yàn)小鼠，隨機(jī)分為兩組，實(shí)驗(yàn)環(huán)境為通風(fēng)良好的房間，12/12 h光/暗周期，溫度24±2℃，并有自由飲水、基礎(chǔ)日糧。小鼠腹腔注射D-半乳糖50（mg·kg-1）·d-16 w，造模老齡小鼠。

2.3 液態(tài)石蠟的配制

準(zhǔn)備好固體石蠟，將其至于60℃烘箱中熔解石蠟，做好標(biāo)記，向石蠟中倒入二甲苯如此反復(fù)幾次。趁石蠟液態(tài)時(shí)將石蠟?zāi)鄢晒虘B(tài)，內(nèi)含待切組織，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)

最大給藥量（Maximum administration dosage）實(shí)驗(yàn)[15]。在前期進(jìn)行的預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果表明無法測(cè)出小鼠口服LBP的LD50，因此，在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇最大給藥量法進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為昆明小鼠，取20只實(shí)驗(yàn)鼠，在試驗(yàn)前12 h對(duì)試驗(yàn)鼠禁食（不禁水），然后對(duì)小鼠進(jìn)行急性經(jīng)口毒理試驗(yàn)，采取最大濃度、最大量體積、一次性灌胃給藥的方法，每日給藥一次，試驗(yàn)時(shí)間為7 d，試驗(yàn)期間連續(xù)給藥。觀察和記錄小鼠出現(xiàn)的毒性反應(yīng)和副作用[16]。試驗(yàn)7 d后，將未死亡的小鼠處死并進(jìn)行尸檢。

2.5 試驗(yàn)小鼠肝臟、腎臟病理切片觀察

在停藥7 d后將存活的小鼠采用斷頸處死的方法進(jìn)行處死。在無菌操作臺(tái)上，迅速取出小鼠的肝臟和一側(cè)腎臟，將取出的肝臟和腎臟樣本放置于中性緩沖福爾馬林固定液中進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片機(jī)切片。采取常規(guī)蘇木精-伊紅（H.E）染色法染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行相應(yīng)的病理學(xué)觀察。

2.6 試驗(yàn)小鼠的血液生理指標(biāo)變化

在停藥7 d后，采用眼球取血的方法對(duì)試驗(yàn)小鼠取血，血液經(jīng)過抗凝處理后，利用血細(xì)胞分析儀，檢測(cè)小鼠的紅細(xì)胞數(shù)（Rbc）、白細(xì)胞數(shù)（Wbc）和血紅蛋白（Hb）含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用Origin7.5分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間差異檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)，多組資料采用單因素方差分析（One-way ANOVA）[17]。

3 結(jié)果與分析

3.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)老齡模型小鼠進(jìn)行最大濃度、最大體積連續(xù)灌胃給藥7 d處理，然后對(duì)老齡模型小鼠生理活動(dòng)和行為進(jìn)行觀察：小鼠毛色光滑、糞便色澤和質(zhì)地與正常小鼠相比無明顯差異，小鼠均正常活動(dòng)，且在灌胃處理的一周內(nèi)無死亡以及其他異常的現(xiàn)象出現(xiàn)。對(duì)老齡小鼠斷頸處死并尸檢，對(duì)各器官進(jìn)行肉眼觀察，經(jīng)初步直接觀察發(fā)現(xiàn)各主要臟器（如心、肺、脾、肝、腎）均無明顯異常的變化。

3.2 肝臟和腎臟的病理切片觀察

在光學(xué)顯微鏡下，急性毒性試驗(yàn)的小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞核清晰，胞漿豐富，中央靜脈居中，肝索向四周呈放射狀分布，肝臟切片觀察結(jié)果正常（圖1 A）。急性毒性小鼠腎臟病理切片顯示，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰可見，腎細(xì)胞排列緊密，腎小球形狀規(guī)則，腎小管結(jié)構(gòu)明顯、清楚（圖1B），與正常的小鼠腎臟切片相比無明顯差異。肝臟和腎臟的切片觀察結(jié)果表明枸杞多糖對(duì)小鼠肝臟和腎臟組織沒有形成明顯的毒性反應(yīng)。

圖1 A肝臟病理（HE×200）Fig.1 AThe pathology of liver（HE×200）

B腎臟病理（HE×200）BThe pathology of kidney（HE×200）

表1 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血象變化（±S.D.n=10）Table 1The mouse blood changes before and after acute toxicity test

表1 急性毒性試驗(yàn)前、后小鼠血象變化（±S.D.n=10）Table 1The mouse blood changes before and after acute toxicity test

Control groupStudy group Testing item Rbc（×1012·L-1）Wbc（×109·L-1）Hb（g·L-1）Pre-test 5.22±0.57 9.64±0.36 144.66±9.12 Post-test 5.39±0.52 9.83±0.31 146.37±8.74 Pre-test 5.77±0.54 9.95±0.42 148.89±9.53 Post-test 5.65±0.57 9.84±0.38 148.89±9.53

3.3 試驗(yàn)前、后小鼠血液生化指標(biāo)的變化

在進(jìn)行小鼠急性毒性試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束一周后，對(duì)小鼠的相關(guān)血液生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示。對(duì)試驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：在急性毒性試驗(yàn)前、后，小鼠血液中的紅細(xì)胞數(shù)（Rbc）、白細(xì)胞數(shù)（Wbc）和血紅蛋白（Hb）含量變化均不大，差異不顯著（P＜0.05），各生理指標(biāo)也均在正常生理范圍內(nèi)。結(jié)果表明枸杞多糖對(duì)小鼠的機(jī)體健康無明顯損傷。

4 結(jié)論與討論

綜上所述，根據(jù)對(duì)小鼠的生理表征及病理切片觀察可知，枸杞多糖對(duì)老齡模型小鼠無毒性，為其臨床研究提供了更加充分的理論證據(jù)。

急性毒性試驗(yàn)（Acute toxicity testing）是指在一日內(nèi)一次或多次應(yīng)用藥物給予動(dòng)物，短期內(nèi)所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及動(dòng)物的死亡情況，為新藥臨床前毒理學(xué)研究的第一步[18]，通過枸杞多糖對(duì)老齡小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，最大量給老齡小鼠灌胃并無明顯的毒性反應(yīng)，說明枸杞多糖為無毒性物質(zhì)。實(shí)驗(yàn)說明，對(duì)小鼠以最大量灌胃一周時(shí)從肉眼觀察可見小鼠的毛色、攝食量、糞便等均無明顯異常，初步證明枸杞多糖的成分對(duì)老齡鼠健康無影響。再深入對(duì)小鼠尸檢情況分析研究，發(fā)現(xiàn)老齡小鼠的心臟、腎、脾、肺等顏色狀態(tài)并無明顯變化異常。對(duì)小鼠臟器進(jìn)行病理切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)老齡小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈居中，肝索向四周呈放射狀分布，胞核清晰。對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠前后的血象觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠Wbc、Rbc、Hb亦無明顯變化，均在正常范圍內(nèi)，說明枸杞多糖對(duì)老齡小鼠的血液無毒性反應(yīng)。經(jīng)Jing L等[19]研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖且具有顯著的降血糖作用。

在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)小鼠對(duì)LBP的作用均無顯差異，可推知LBP對(duì)小鼠的作用無明顯差異。且由實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，灌服LBP的小鼠生理表征良好，且與對(duì)照組相比較，衰老程度減慢。Harunobu Amagase等人研究發(fā)現(xiàn)，枸杞對(duì)小鼠的總體幸福感及耐力的提升具有一定的幫助[20]。

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Acute Toxicity Experimental Study of Barbarum Polysaccharide on Aged Mice

Yan Ziyi
（College of life Science，Northeast Agricultural University，Haerbin 150030）

One day maximum tolerance test was adopted to study the acute toxicity of Lycium barbarum polysaccharide on aged mice.12 hours of fasting（except water）before the test，then acute oral toxicity test was conducted using daily maximum concentration and volume，disposable intragastric administration，observed for 7 days，behavior，food intake，weight，stool and mortality of the mice were recorded to study the safety evaluation ofLycium barbarumpolysaccharide on aged mice.The coat color，food intake，weight and stool were not abnormal significantly after the aged mice were given by gavage LBP with maximum dose and volume.And the liver，spleen pathological section and blood had no obvious abnormalities either.It could conclude that there was no toxic effects ofLycium barbarumpolysaccharide on aged mice.

Lycium barbarumpolysaccharide；acute toxicity；D-galactose；safety

R285.5

A

1002-2090（2017）04-0078-04

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.04.017

2016-12-20

嚴(yán)子祎（1996-），女，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院制藥工程專業(yè)2014級(jí)學(xué)生。