人脂肪干細胞（ADSCs）體外培養(yǎng)的研究及應(yīng)用進展

干細胞是一類具有自我更新與增殖能力的細胞，按其分化階段不同分為胚胎干細胞與成體干細胞，目前對成體干細胞的研究較為廣泛。人的脂肪干細胞（adipase derived stem cells，ADSCs）是來源于脂肪組織的干細胞，具有自我更新及多向分化的能力，在適宜誘導(dǎo)條件下可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。自從2001年ZUK[1]首次通過吸脂術(shù)抽取脂肪組織懸液培養(yǎng)出多能干細胞，ADSCs因其取材方便，一次取材獲取的細胞數(shù)量大，對供體創(chuàng)傷小等優(yōu)點已成為近年來種子細胞的研究熱點。

1 ADSCs的獲取

脂肪組織是人體中含量最豐富的組織，占正常體重的10%～29%[2]。它的存在主要有兩種形式：棕色脂肪組織及白色脂肪組織。其中棕色脂肪組織僅在嬰兒期發(fā)揮作用，而白色脂肪組織在人體起到儲存及釋放能量的調(diào)節(jié)器作用，主要分布在腹腔內(nèi)的網(wǎng)膜、腸、腎周及臀部、大腿、腹部的皮下區(qū)域[3]。因此研究重點集中在白色脂肪組織。目前，ADSCs主要通過局部脂肪切除術(shù)及抽脂術(shù)后的脂肪組織中獲取，但Vallee等[4]發(fā)現(xiàn)由抽脂術(shù)獲得的脂肪有更好的成脂潛力、重建三維脂肪替代物能力。供者的年齡也是影響ADSCs的因素。一般來說供者的年齡越小，細胞增生能力越好，反之亦然。然而，AustL等[5]卻認為ADSCs的衰老與供體的體質(zhì)指數(shù)呈負相關(guān)，而與年齡無關(guān)。取材部位不同，ADSCs數(shù)量凋亡傾向也不同。Schipper等[6]發(fā)現(xiàn)人前臂脂肪組織中含有更多的脂肪干細胞，而腹部的ADSCs不容易凋亡；腹部似乎比臀部或大腿更有利于獲取ADSCs[7]。

2 ADSCs分離培養(yǎng)

2.1分離：目前常用的是酶消化法，將脂肪組織剪碎后采用膠原酶或胰酶消化、過濾離心后，使用含血清的培養(yǎng)基將沉淀重懸后接種于培養(yǎng)瓶中。沉淀物是多種細胞的混合物，又稱為血管基質(zhì)成分（Stromal vascular fraction，SVF），其中含有內(nèi)皮細胞、周細胞、平滑肌細胞、前脂肪細胞、間充質(zhì)干細胞及血液來源的細胞，常需傳代來純化。

2.2 培養(yǎng)：體外培養(yǎng)需要合適的生長條件，培養(yǎng)基的選擇很重要。常用的培養(yǎng)基有DMEM、a-MEM、RPMI1640。Lee等[8]報道L-DMEM比a-MEM更適合培養(yǎng)ADSCs。Mischen等[9]研究表明低糖更有利于維持ADSC的多分化潛能，而培養(yǎng)液中的抗生素對ADSC的細胞表型和分化能力無影響。Bunnell等[10]認為25%血清濃度可能使ADSC向脂肪細胞分化，而低氧低血清可增加ADSC凋亡。對于最優(yōu)的糖濃度及血清濃度尚不明確。為了消除動物血清的使用帶來的不良影響，部分文獻開始介紹低人血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基的使用。Dromard等[11]將ADSCs作為一種浮動的球體培養(yǎng)在無血清培養(yǎng)基中仍能維持較好的分化能力。從血小板釋放的血小板源性生長因子（PDGF）-AB和轉(zhuǎn)移性生長因子TGF-β1在人ADSCs及人真皮纖維細胞顯示了一定的增長潛力[12]。在培養(yǎng)中還需要考慮到細胞接種密度、培養(yǎng)時間及傳代次數(shù)。低密度種植可避免細胞克隆間的相互作用，可能更有利于ADSCs的培養(yǎng)[8]。國內(nèi)朱艷霞等[13]發(fā)現(xiàn)ADSCs每隔14天傳代可以獲得更多更高質(zhì)量的干細胞，ADSC增殖至25代以上仍保持干細胞表型特征及多向分化潛能。

3 ADSCs的鑒定

ADSCs的鑒定主要依靠3個標準：①細胞形態(tài)及自我更新能力；②表面抗原分子表達；③多向分化潛能。Zuk等[1]觀察到ADSCs在接種后4h開始出現(xiàn)貼壁，24～48h細胞生長處于停滯狀態(tài)，形態(tài)呈小圓形，直徑約5um；48h后細胞出現(xiàn)伸展，呈纖維細胞樣短梭形；5～6天后細胞呈集落樣生長，有克隆形成。ADSCs目前并無特異性表面標志，通常采用流式細胞儀和免疫組化來對其進行鑒別。ADSCs陽性表達CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49e、CD54、CD55、CD63、CD71、CD73、CD90、CD91、CD105、CD144、CD146、CD166等，不表達CD3、CD11b、CD14、CD19、CD31、CD38、CD45、STRO-1、CD117、CD62L、CD95L、HLA-DR等，對是否表達CD34尚存在爭議[14-16]。ADSCs與間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在形態(tài)上無法區(qū)別開來，免疫表型上均共同表達CD29、CD44、CD105、CD166、CD49e，不表達CD31、CD45、HLA-DR、CD133、C-kit、Lin、CD11b[17]。不過也有發(fā)現(xiàn)ADSCs肯定表達CD49d，肯定不表達CD106；而MSCs與之正好相反[18]；ADSCs分化為脂肪細胞的效率更高，而MSC分化為骨和軟骨的能力更高[19]。表明兩者還是存在區(qū)別。另外，ADSCs分化能力可通過誘導(dǎo)分化為多種成熟功能細胞來證實。

4 ADSCs的凍存

干細胞在長期培養(yǎng)傳代易受到微生物污染、基因型改變、生理生化特性改變等情況的影響，而ADSCs在長期培養(yǎng)中還易自發(fā)分化，而失去多向分化能力，需要對其進行低溫保存。常用細胞凍存的方法包括：①程序降溫法；②過冷保存法；④玻璃化保存法[20]。低溫凍存中重要因素為低溫保護劑、冷卻速率和復(fù)溫過程[21]。樊艷等[22]通過“慢凍快融”的方法，證實成人ADSCs可以耐受短期及較長期低溫凍存，復(fù)蘇后ADSCs存活率較高。劉廣鵬等[23]發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)的細胞低溫保存技術(shù)對ADSCs體外增殖及成骨能力無明顯影響。不經(jīng)過傳統(tǒng)的程序凍存法，直接將ADSC懸液置于-70°冰箱貯存證明是一種可行方法[24]。

5 脂肪組織工程中的分子材料應(yīng)用

無論是將干細胞分化成所需要的細胞，或有效應(yīng)用于構(gòu)建三維結(jié)構(gòu)，特定的組織支架和信號系統(tǒng)都是十分必要的。支架材料可以為種子細胞提供粘附表面，模擬一定的外形，引導(dǎo)組織再生，便于細胞-支架重組體的操作。常見脂肪組織工程的三維支架材料有天然細胞外基質(zhì)和可生物降解聚合物兩種。天然的細胞外基質(zhì)有膠原凝膠、透明質(zhì)酸衍生物、基底膠、纖維蛋白凝膠等；可生物降解聚合物包括聚乙烯乙二醇雙丙烯酸酯（polyethylene glycol diacrylate，PEDGA）、聚乙醇酸（polyglycolic acid，PGA）、乙醇酸（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）、聚乙烯對苯二酸酯（polyethylene terephthalate，PET）、聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）等[25]。有報道指出膠原微珠是良好的支架，它足夠小用于注射且在體內(nèi)能增殖、分化[26]；而植入ADSCs的透明質(zhì)酸海綿的支架是穩(wěn)定的細胞支架，有產(chǎn)生固定量組織的潛力[27]；ADSCs也能較好地在I型膠原上粘附、生長、增殖[28]；注射的PLGA球體被作為一種侵入性的軟組織填充物[29]；在體外可溶因子作用下，多孔的PLGA能促進ADSC生成和成脂分化[30]；Altman等[31]描述的絲素殼多糖支架，使用該支架能增強傷口愈合及向修復(fù)組織的內(nèi)皮、上皮成分轉(zhuǎn)化。Melanie Vermette等[32]提出“自裝配技術(shù)”的脂肪組織工程策略，該方法脫離了生物合成材料，形成的結(jié)構(gòu)似乎更接近正常的皮膚結(jié)構(gòu)。每種方法都各有優(yōu)劣，但化學(xué)的合成物、力學(xué)穩(wěn)定性及3D的體系結(jié)構(gòu)對脂肪組織工程是至關(guān)重要的因素，必須確保移植后結(jié)構(gòu)內(nèi)細胞的滲透、有效的增殖及完全的分化[33]。

6 臨床應(yīng)用及展望

ADSCs具有取材方便、易培養(yǎng)、分化潛能大，可在體外穩(wěn)定增殖傳代等特點，成為干細胞領(lǐng)域的新熱點，其研究應(yīng)用的領(lǐng)域可涉及到組織工程、心血管疾病、代謝性疾病、關(guān)節(jié)炎性疾病等多個方面。如Yoshimura等[34]應(yīng)用于23例軟組織缺損、胸部的填充，除有1例出現(xiàn)中心區(qū)域纖維化，其余在體積上都保持長期的效果。Lee等[35]發(fā)現(xiàn)ADSCs在再生胰腺提取物刺激下有分化為各種胰島細胞的潛能。Kim等[36]報道ADSCs可分泌各種皮膚生長因子，促進成纖維細胞增殖，具有抗光老化、抗皺等作用。Yuan等[37]將ADSCs與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)ADSCs能通過直接接觸促進表皮角質(zhì)形成細胞遷移。Guiting Lin等[38]研究顯示前列腺癌細胞可以通過CXCL12/CXCR4軸招募ADSCs細胞，同時ADSCs能在FGF2作用下靠增加腫瘤血管供應(yīng)來促進腫瘤生長；這為研究腫瘤細胞提供新的思路。然而還有一些問題有待解決：①尋找ADSCs特異的標志物及如何更好地純化ADSCs的方法；②ADSCs的移植是否存在最佳時機或劑量，異體ADSCs移植是否有強烈的免疫反應(yīng)或后期的排斥反應(yīng)；③如何構(gòu)建合適大小的脂肪組織，如何使構(gòu)建的脂肪組織長期保持活力。相信隨著研究的不斷深入，上述問題會得到很好的解決。

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[收稿日期]2012-03-29 [修回日期]2012-05-14

編輯/李陽利