單細(xì)胞測序技術(shù)及其在乳腺癌中的應(yīng)用進(jìn)展

杜彥宏，季雄娟

（無錫市錫山人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 無錫 214105）

1 單細(xì)胞測序技術(shù)概況

SCS技術(shù)是一種在單細(xì)胞水平上分析基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳的強(qiáng)大的方法，近幾年來，測序技術(shù)方面已取得了大量突破。2013年，首次利用SCS技術(shù)對腫瘤病人單個外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行全基因組、外顯子組測序，為無創(chuàng)腫瘤診斷和監(jiān)測提供了一種新的技術(shù)手段[2]。

2 單細(xì)胞測序技術(shù)原理[3-8]

單細(xì)胞測序技術(shù)主要包括單細(xì)胞基因組測序、轉(zhuǎn)錄組測序、表觀遺傳學(xué)測序及多組學(xué)測序。

2.1 單細(xì)胞基因組測序

對目的細(xì)胞的全部基因組序列進(jìn)行非選擇性、均勻擴(kuò)增，隨后進(jìn)行高通量測序，進(jìn)而在全基因組水平上研究腫瘤進(jìn)化、配子發(fā)生、體細(xì)胞嵌合現(xiàn)象。

2.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序

對采集患者樣本的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行測序，揭示了胚胎早期發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞重編等過程中的動態(tài)基因表達(dá)和相關(guān)的基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。

2.3 各種表觀遺傳學(xué)測序

表觀遺傳學(xué)是描述基因組功能上的相關(guān)改變，不涉及非致瘤性單細(xì)胞核苷酸序列的改變，能更準(zhǔn)確描述單個腫瘤細(xì)胞的基因組命運(yùn)。表觀遺傳包含細(xì)胞中所有遺傳標(biāo)記及其染色體的表型，定義細(xì)胞發(fā)育和癌癥進(jìn)展的每個階段進(jìn)而決定了細(xì)胞的異質(zhì)性。其中單細(xì)胞甲基化組測序剛剛起步，為個性化腫瘤治療提供依據(jù)，在癌癥和干細(xì)胞研究中顯示出巨大潛力。

2.4 多組學(xué)測序

同時進(jìn)行單細(xì)胞基因組和轉(zhuǎn)錄組兩組測序，可以采用微流體的方式將兩者分離進(jìn)行測序或者采用物理方法將兩者分離測序。也可同時進(jìn)行三重組學(xué)的測序，從而可以同時得到來自同一細(xì)胞的基因組、轉(zhuǎn)錄組和DNA甲基化的信息。還有許多其他方面的測序嘗試仍在繼續(xù)。

3 單細(xì)胞測序技術(shù)方法

單細(xì)胞測序技術(shù)主要包括以下4個步驟：單細(xì)胞分離獲取，DNA或RNA序列擴(kuò)增，基因測序及數(shù)據(jù)分析。

在五原鹽堿地治理的過程中，各企業(yè)、院校、科研機(jī)構(gòu)以土地流轉(zhuǎn)的形式參與到鹽堿地治理中，其中以硅谷肥業(yè)尤為突出，共計流轉(zhuǎn)3000多畝土地，其中包括800多畝輕度鹽堿土地、1000多畝中度鹽堿土地、1200畝核心重度鹽堿土地。硅谷公司采取多種肥料結(jié)合，多種施肥方案，多種作物種植等方式，針對流轉(zhuǎn)區(qū)域進(jìn)行改良，并取得顯著成效。同時，硅谷肥業(yè)還在五原的豐裕辦事處、新公中鎮(zhèn)、復(fù)興鎮(zhèn)等實施惠農(nóng)措施，并開展了多個鹽堿治理示范園區(qū)。硅谷有機(jī)硅功能肥在五原縣鹽堿地改良治理的成功獲得了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部耕保中心和多個省、市、地區(qū)的農(nóng)業(yè)技術(shù)及相關(guān)部門、科研機(jī)構(gòu)的關(guān)注。

3.1 單細(xì)胞分離獲取[9-15]

單細(xì)胞標(biāo)本傳統(tǒng)上是從腫瘤組織或體液的活檢中獲得的，為了從大量混雜細(xì)胞中分離出目標(biāo)細(xì)胞需要選擇以下方法（無限稀釋法、單細(xì)胞顯微鏡操作法、流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞法、激光捕獲顯微切割法、微流控技術(shù)等），這些方法各有利弊，要根據(jù)具體的情況進(jìn)行方法的選擇。

3.1.1 無限稀釋法

將目的細(xì)胞群從新鮮組織中分離出來，然后放入懸浮液中，進(jìn)行倍比稀釋，直至獲得單個目的細(xì)胞。該方法的局限性在于操作員對技術(shù)的掌握程度，分離多個細(xì)胞的較高概率以及較低的獲取率。

3.1.2 單細(xì)胞顯微鏡操作法

在高倍鏡下分選細(xì)胞，但有操作難度大，獲取數(shù)量較少的缺點。

3.1.3 流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞

通過熒光標(biāo)記，根據(jù)細(xì)胞各自的特性，分選單個細(xì)胞或細(xì)胞群的技術(shù)。

3.1.4 激光捕獲顯微切割

利用激光脈沖將目標(biāo)切片附在有熱塑膜的涂片上，進(jìn)而實現(xiàn)細(xì)胞分離。主要應(yīng)用于癌癥單細(xì)胞的分離研究。

3.1.5 微流控技術(shù)

利用微流控芯片上的微管道進(jìn)行多種單細(xì)胞分選。這種方法可以批量測序所有的基因，從而降低了單細(xì)胞測序的成本，提高了測序效率，同時也方便了研究者。因此，微流控技術(shù)是目前最理想的單細(xì)胞分離方法，具有廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)行規(guī)?；耐茝V和應(yīng)用。

3.2 DNA或RNA序列擴(kuò)增

由于現(xiàn)階段任何測序技術(shù)都無法直接對單個細(xì)胞提取的微量核酸進(jìn)行檢測，故必須通過全基因組擴(kuò)增和全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)，獲取到足量的核酸，從而構(gòu)建DNA或RNA文庫，為分析基因突變和拷貝數(shù)改變以及確定單個細(xì)胞中特定的細(xì)胞基因表達(dá)提供了基礎(chǔ)。測序結(jié)果的正確與否取決于單細(xì)胞DNA和RNA擴(kuò)增的數(shù)量和質(zhì)量，所以DNA和RNA擴(kuò)增方法的選擇顯得尤其重要。

3.2.1 全基因組擴(kuò)增

將單個細(xì)胞的微量全基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過外顯子捕獲進(jìn)而高通量測序用于揭示細(xì)胞群體差異。常見的方法有聚合酶鏈反應(yīng)法（PCR）、多重置換擴(kuò)增技術(shù)（MDA）。PCR法是第一個針對SCS開發(fā)的方法但擴(kuò)增效率低，MDA法已被廣泛報道，從單細(xì)胞基因組或外顯子組可以獲得高的物理覆蓋率（＞90%），這是測量堿基突變的理想方法[16]。近年，又有一種方法，Stepanauskas[17]等提出了一種組合M D A 和FA C S 并改進(jìn)的方法，即WGA-X。該方法增強(qiáng)了單個微生物細(xì)胞和病毒基因組回收效率。

3.2.2 全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)

全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)是SCS的關(guān)鍵步驟，RNA測序的第一步是開發(fā)有效的全轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增方法。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增的方法主要有唐氏法（Tang's method）、Smart-seq1、Smartseq2、線性擴(kuò)增法等。但SMART技術(shù)不穩(wěn)定，低水平表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組可能會丟失[18-19]。在過去的幾年里，擴(kuò)增技術(shù)取得了很大的進(jìn)展，單個細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增技術(shù)中存在的弊端逐漸被修復(fù)。

3.3 基因測序

利用各種測序方法，分析DNA或RNA堿基序列、基因的表觀遺傳修飾。

3.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析是指通過各種算法對測序結(jié)果進(jìn)整理篩選，從測序結(jié)果中獲取有用信息的一種方法。目前單細(xì)胞測序技術(shù)仍存在多種固有技術(shù)錯誤，改進(jìn)生物信息學(xué)分析技術(shù)是關(guān)鍵。隨著技術(shù)不斷發(fā)展，SCS技術(shù)及其在腫瘤個體化治療中的應(yīng)用前景廣泛[20]。

4 單細(xì)胞測序在乳腺癌中的應(yīng)用進(jìn)展

4.1 揭示乳腺癌細(xì)胞的異質(zhì)性，指導(dǎo)個體化治療

2017年chung等[21]分析了來自11名患者的515個細(xì)胞。從單細(xì)胞RNA-seq數(shù)據(jù)中推斷出的拷貝數(shù)變化，從而將癌細(xì)胞與非癌細(xì)胞區(qū)分開。在單細(xì)胞分辨率下，乳腺癌細(xì)胞在腫瘤內(nèi)表現(xiàn)出一部分相同的特征，以及發(fā)現(xiàn)了與乳腺癌亞型和關(guān)鍵的腫瘤通路有關(guān)的瘤內(nèi)異質(zhì)性。大多數(shù)非癌細(xì)胞是免疫細(xì)胞，有三種不同的T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均表現(xiàn)出免疫抑制特征：T細(xì)胞具有調(diào)節(jié)或衰竭表型，巨噬細(xì)胞具有M2表型。這些結(jié)果說明乳腺癌轉(zhuǎn)錄組具有廣泛的瘤內(nèi)異質(zhì)性，瘤內(nèi)異質(zhì)性是導(dǎo)致臨床治療無效的原因之一[22]。因此了解乳腺癌異質(zhì)性水平以及微環(huán)境基因表達(dá)可能有助于確定更好的預(yù)后和治療的分子靶點，進(jìn)行精準(zhǔn)治療。

4.2 分析乳腺癌轉(zhuǎn)移和進(jìn)展

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）來源于原發(fā)腫瘤，通過循環(huán)遷移到其他部位從而導(dǎo)致腫瘤患者大部分死亡。2015年，Lawson等[23]利用單細(xì)胞測序?qū)Σ煌制诘霓D(zhuǎn)移性乳腺癌進(jìn)行基因表達(dá)分析，揭示了原發(fā)腫瘤，CTCs和轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的個體基因組的之間的關(guān)聯(lián)。對 CTCs 進(jìn)行單細(xì)胞測序主要具有兩大應(yīng)用價值：一是操作過程更加簡化且得到純度更高的腫瘤細(xì)胞；二是對樣本質(zhì)量的要求更低，能夠?qū)λ械奈⒘緿NA或RNA做出精準(zhǔn)分析?？偠灾?，單細(xì)胞測序檢測CTCs能更好的提示轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的預(yù)后和對治療的反應(yīng)[24]。

4.3 探索乳腺癌耐藥機(jī)制

由于腫瘤耐藥而復(fù)發(fā)的患者不計其數(shù)，這也是腫瘤治療無效的原因之一。三陰性乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性亞型腫瘤，常發(fā)生化療耐藥。2018年，Kim等[25]使用了單細(xì)胞DNA和RNA測序?qū)?0例三陰性乳腺癌患者的化療前和化療后的腫瘤組織進(jìn)行測序，結(jié)果表明，耐藥基因型是預(yù)先存在的，但腫瘤細(xì)胞的耐藥表達(dá)譜是在化療后經(jīng)轉(zhuǎn)錄重編碼而獲得的。這個發(fā)現(xiàn)對于克服乳腺癌的化療耐藥及尋找新的治療靶點具有積極作用。

5 小結(jié)與展望

隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展，在探尋乳腺癌的異質(zhì)性，進(jìn)化過程，轉(zhuǎn)移及耐藥性等方面成為有力的工具。但目前單細(xì)胞測序技術(shù)對乳腺癌的研究尚且單一，不能完整的揭示整個腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥的過程，突破單細(xì)胞甲基化組測序是我們新的方向。我們目前為止所討論的單細(xì)胞測序技術(shù)只能描述遺傳信息的一個維度，我們希望未來有望利用在單細(xì)胞水平進(jìn)行基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀基因組等多種組學(xué)的綜合研究合并分析，從而更加系統(tǒng)全面地分析乳腺腫瘤細(xì)胞的基因變化，有助于臨床中對乳腺癌患者的個體化靶向治療，提高療效，實現(xiàn)個體化精準(zhǔn)醫(yī)療。