污水處理廠耐β—內(nèi)酰胺類乳糖發(fā)酵型腸桿菌Ⅰ類整合子及基因盒研究

徐佳麗+王小嬌+張明+任雪麗+江濤

摘 要：該文首先用 PCR等方法，對閔行污水處理廠分離的β-內(nèi)酰胺類抗性菌株中Ⅰ類整合子和基因盒的存在情況進行測定；其次，對含有Ⅰ類整合子-基因盒的抗性菌株抽提質(zhì)粒，分析Ⅰ類整合子-基因盒所在位置；最后，探討了含有整合子-基因盒菌株對多種抗生素的反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：β-內(nèi)酰胺類抗性菌株；Ⅰ類整合子；基因盒

中圖分類號 X703 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）07-15-03

Abstract：In this paper，PCR techniques were used to detect the presence of classⅠintegron and gene β-lactam antibiotics which selected from sewage water samples. Second，the plasmid DNA were extracted from β-lactam resistant strains with classⅠintegron and gene cassette，which detected the position of classⅠintegron and gene cassette. Finally，the response of a strain containing classⅠintegron and gene cassette to antibiotics were investigated.

Key words：β-lactam antibiotics；ClassⅠintegron；Gene cassettes.

1 前言

隨著抗生素使用越來越頻繁，細菌具有了更強的抗藥性，從而使耐藥性廣泛傳播。耐藥基因的水平傳播主要由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體介導(dǎo)，而整合子起著至關(guān)作用[1]。Stokes[2]在1989年首次提出了整合子的概念，Hall[3]在1991年正式提出了基因盒-整合子系統(tǒng)的概念。整合子是細菌DNA片段，與細菌耐藥性密切相關(guān)[4]，是一種存在于細菌質(zhì)?；蛉旧w上的遺傳元件系統(tǒng)，通過自身編碼的整合酶來獲取外源基因并使之表達。

整合子由5′-保守末端（CS）、3′-保守末端及位于2段保守序列之間的可變區(qū)組成，它能夠捕獲、整合及表達耐藥基因。5′-CS是整合子的基本結(jié)構(gòu)，包括一個編碼整合酶的IntⅠ基因、一個整合子重組位點attI和啟動子（Pant）[5]。中間可變區(qū)域有不同種類和數(shù)量的耐藥基因盒，表現(xiàn)出多耐藥特征。而基因盒是一種結(jié)構(gòu)比較小的、自己無法轉(zhuǎn)錄翻譯，需要借助外界力量來幫助自己表達，而整合子經(jīng)常是它的首選目標?；蚝型ㄟ^整合子上整合酶被整合到整合子中或從整合子里被剪切下來，使耐藥基因得以傳播與擴散[6]。3'-CS的結(jié)構(gòu)因整合子種類而不同。

到目前為止，Ⅰ類整合子是研究最多也是被檢測到最多的。Ⅰ類整合子的5′-CS部分一般相似，而3′-CS存在差異。多數(shù)3′-保守端有3個開放的基因讀碼框：磺胺耐藥基因（SulⅠ），季銨鹽化合物及溴乙錠的耐受基因（qacE△1），以及功能尚不清楚的ORF5[5]。本實驗主要通過PCR等方法檢測污水廠分離的39株抗性菌株的Ⅰ類整合子以及基因盒的存在情況。通過對含有Ⅰ類整合子-基因盒系統(tǒng)的抗性菌株提取質(zhì)粒，分析Ⅰ類整合子-基因盒所在的位置。最后，探討了整合子在介導(dǎo)LFE對抗生素產(chǎn)生多重抗性的作用。

2 實驗方法

2.1 樣本采集及DNA的提取 實驗菌株來自閔行污水廠中分離的39株耐β-內(nèi)酰胺類乳糖發(fā)酵型腸桿菌。用水煮法（99.5℃，10min）裂解提取菌落DNA。同時做好標記保存使用。

2.2 抗性菌株Ⅰ類整合子基因檢測 將水煮提取的39個菌落DNA在Ⅰ類整合子基因擴增引物下進行PCR檢測，反應(yīng)總體系為30μL：3μL 10×PCR Buffer，1.8μL MgCl2，3μL dNTPs，正、反向引物各0.6μL，2μL DNA模板，0.2μL的Taq聚合酶，18.8μL超純水。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變型30s，59℃退火30s，72℃延伸60s，30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。最后在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2.3 抗性菌株Ⅰ類整合子基因盒檢測 用上述使用過的39個菌落DNA在Ⅰ類整合子基因盒擴增引物下進行PCR檢測，反應(yīng)總體系為30μL：3μL 10×PCR Buffer，1.8μL MgCl2，6μL dNTPs，正、反向引物各1.2μL，4μL DNA模板，0.4μL的Taq聚合酶，12.4μL超純水。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性7min，94℃變型40s，59℃退火40s，72℃延伸80s，30個循環(huán)，72℃延伸10min，最后在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

2.4 帶Ⅰ類整合子抗性菌株整合子位置確定 用質(zhì)粒抽提試劑盒（桑尼生物科技有限公司）對閔行污水廠中分離的39株耐β-內(nèi)酰胺類乳糖發(fā)酵型腸桿菌抽提質(zhì)粒。用PCR方法對抽提的質(zhì)粒做整合子及基因盒檢測，步驟同上面2個實驗相同。

2.5 β-內(nèi)酰胺類抗性菌株對多重抗生素的耐藥性研究 將分離出的含有39株β-內(nèi)酰胺抗性菌株分別轉(zhuǎn)接于含有濃度為50μg/mL的氨芐西林鈉、16μg/mL的頭孢呋辛鈉、20μg/mL的四環(huán)素的麥康凱瓊脂平板中，37℃培養(yǎng)24h。

3 結(jié)果與分析

3.1 抗性菌株Ⅰ類整合子-基因盒檢測結(jié)果 取9、10、11月從閔行污水處理廠分離出的39株具有2種以上抗性基因的Ⅰ類整合子-基因盒檢測結(jié)果，見表1。從表1可以得出：在分離的39株具有多個抗性基因的菌株中，其中約15.38%含有Ⅰ類整合子但不含有基因盒；15.38%含有基因盒但是在intⅠ上沒有檢測到；同時15.38%的菌株檢測出Ⅰ類整合子及基因盒，另外約有30.77%未含有Ⅰ類整合子和基因盒。其中對于都含有Ⅰ類整合子及基因盒的月份上分析：11月份<9月份<10月份，這在一定程度上反應(yīng)出耐藥性的傳播和抗藥性的爆發(fā)期可能與時間有關(guān)。由此可知，環(huán)境中含有較多的Ⅰ類整合子-基因盒這個系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的菌株與環(huán)境中細菌抗性藥提高有著密切聯(lián)系。

3.2 Ⅰ類整合子-基因盒位置的分析 對含有Ⅰ類整合子-基因盒的6株菌進行了對該系統(tǒng)位置的研究，結(jié)果表明，這6株菌的質(zhì)粒DNA也都能檢測到該系統(tǒng)，說明這6株的Ⅰ類整合子-基因盒系統(tǒng)均位于質(zhì)粒上。

3.3 β-內(nèi)酰胺類抗性菌株多重耐藥性的研究 攜帶Ⅰ類整合子-基因盒系統(tǒng)的抗性菌株在不同抗生素中生長情況，結(jié)果見表3。從表3可以看出：SA15、OC4、OD6這3株菌能在氨芐西林鈉、頭孢呋辛鈉、四環(huán)素這3種抗生素中生長，說明這3株菌對這3種抗生素都具有抗性，即為多重抗性菌。另外，這也從側(cè)面反映出含有Ⅰ類整合子-基因盒的細菌對抗生素極易表現(xiàn)出多重抗性。

4 結(jié)論

在閔行污水處理廠分離出的39株帶有多重抗性的菌株中，Ⅰ類整合子的檢出率為30.77%，基因盒的檢出率為30.77%，同時帶有整合子-基因盒系統(tǒng)的檢出率為15.38%[7]。對6株含有Ⅰ類整合子-基因盒的β-內(nèi)酰胺類抗性菌株對其質(zhì)粒檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這6株菌的質(zhì)粒上都檢測到了Ⅰ類整合子-基因盒的存在。β-內(nèi)酰胺類抗性菌株中的Ⅰ類整合子-基因盒可能位于質(zhì)粒上。整合子在介導(dǎo)β-內(nèi)酰胺類抗性菌株對抗生素產(chǎn)生多重抗藥性的過程中起到了重要作用。

參考文獻

[1]馮銀，陳體，伍勇.整合子介導(dǎo)細菌耐藥調(diào)控機制的研究進展[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（10）：1260-1262.

[2]Stokes HW，Hall RM.A novel family of potentially mobile DNA elements encoding site-specific gene-integration functions： integrons [J]. Mol Microbiol，1989，3（12）：669-1683.

[3]Hall R M，Collis C M. Mobile gene cassettes and integrons：capture and spread of genes by site-specific recombination [J]. Mol Microbiol，1995，15（4）：593-600.

[4] Seputienv，Povilonisj，Ruzaukasm，et al.Prevalence of trimethoprim resistance genes in Escherichia coli isolates of human and animal origin in Lithuania[J].J Med Microbiol，2010，59 （Pt3）：315-322.

[5]李曉娜，張金寶，王桂琴.整合子-基因盒介導(dǎo)細菌耐藥基因水平傳播的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)科技版，2015（01）：47-49.

[6] Partridgesr，Tsafnatg，Colerae，et al. Gene cassettes and cassette arrays in mobile resistance integrons[J].FEMS Microbiol Rev，2009，33（4）：757-784.

[7]王小嬌.污水廠耐耐β-內(nèi)酰胺類抗生素乳糖發(fā)酵型腸桿菌耐藥基因的研究[D].上海：華東師范大學(xué)，2010.

（責(zé)編：張宏民）