豬乳鐵蛋白基因的克隆及其重組乳酸菌表達系統(tǒng)構(gòu)建

唐麗杰，哈 卓，趙麗麗，宗曉淋，劉荻，喬薪媛，姜艷萍，葛俊偉，李一經(jīng)，單安山

（1.東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；3.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，哈爾濱 150030）

乳鐵蛋白（Lactoferrin,LF）是一種天然活性鐵結(jié)合糖蛋白，廣泛存在于動物的乳汁（初乳）、血液、唾液、小腸液等外分泌液或血漿、中性粒細胞中。其中除乳腺組織中含量豐富外，其他組織中均含量甚微。LF是一種具有多種生物學功能的蛋白質(zhì)，它不僅參與鐵的轉(zhuǎn)運，而且具有抗微生物、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能。在動物生產(chǎn)中使用乳鐵蛋白及其酶解產(chǎn)物乳鐵蛋白活性肽（Lactoferricin,LFcin），可以降低仔豬的缺鐵性貧血發(fā)病率、提高斷乳仔豬的免疫機能和改善腸道微生態(tài)環(huán)境，促進斷乳仔豬健康生長。

鑒于乳鐵蛋白的廣泛生物學活性，目前在高效補鐵劑、飼料添加劑、免疫調(diào)節(jié)劑以及抗氧化劑等方面正廣泛應用，但是由于傳統(tǒng)的乳鐵蛋白分離從初乳中進行提取純化工藝繁瑣，因此以基因工程手段生產(chǎn)乳鐵蛋白是該技術(shù)的主要方法[1－6]。作為基因工程的宿主菌無論是大腸桿菌、酵母菌，還是動物細胞，表達的外源蛋白大多需純化，而繁瑣的純化工藝一直是基因工程產(chǎn)品不能應用于生產(chǎn)實踐的障礙。

而乳鐵蛋白對于鐵需求低的乳酸菌基本不抑制，且能促進動物腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌群生長；作為載體傳遞系統(tǒng)的干酪乳桿菌是一種益生菌，國內(nèi)外許多研究結(jié)果表明其可作為一種理想的表達細胞，具有目前所知的其他真核或原核生物無法媲美的優(yōu)越性。因此本研究以泌乳豬乳腺組織RNA為模板，獲得豬乳鐵蛋白基因的克隆，同時以乳桿菌質(zhì)粒作為表達載體，構(gòu)建表達豬乳鐵蛋白基因的多種重組乳酸菌，為獲得豬乳鐵蛋白的乳酸菌表達及篩選最佳生物學活性的重組豬乳鐵蛋白奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌和乳酸菌穿梭表達分泌型載體質(zhì)粒pPG612.1，Lactobacillus casei ATCC393由荷蘭Jos Seegers博士惠贈；Lactobacillus plantarum KLDS 1.0344，Lactobacillus paracasei KLDS1.0 652，Lactobacillus pentosus KLDS1.0413源自乳品科學教育部重點實驗室；pMD18－T載體購自大連寶生物工程有限公司；大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞由本實驗室保存。

1.2 引物

應用Oligo6.0軟件設計引物，引物PF1、PF2用于RT－PCR從乳腺組織中擴增豬乳鐵蛋白基因N端序列，并分別含有Bam HⅠ和XholⅠ酶切位點。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列如下：PF1：5′GAGCTCAATGAAGCTCTTCATCCC 3′；PF2：5′CTCGAGCTTCGCCTGCCGCGC 3′。

1.3 豬乳腺組織RNA的提取

取泌乳3 d的長白豬乳腺組織在液氮中研磨成粉末，按照每50～100 mg組織加入1 mL Trizol液裂解乳腺組織細胞，進一步使用氯仿抽提及異丙醇沉淀提取RNA，－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-PCR擴增豬乳鐵蛋白基因N端序列

利用設計合成的P2引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，并以其為模板，按照如下過程進行PCR擴增豬乳鐵蛋白基因N端序列，95℃預變性5 min，94℃1 min，57℃1 min，72℃1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min；反應結(jié)束后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增結(jié)果。將獲得的基因命名為PLFN。

1.5 PLFN基因的克隆

將獲得的PLFN基因PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后與pMD18－T載體進行16℃連接過夜；連接產(chǎn)物將用于轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞。在LB瓊脂平板上挑取菌落接種于 5 mL 含 100 μg·mL－1Amp的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，按《分子克隆實驗指南》的堿裂解法小劑量制備質(zhì)粒的步驟提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行Sac I單酶切，Sac I、Xhol I雙酶切鑒定，同時進行PCR鑒定及序列測定分析。陽性重組質(zhì)粒命名為 pMD18－T－PLFN。

1.6 帶有粘性末端的目的基因片段及干酪乳桿菌表達載體的制備

用小量質(zhì)粒DNA提取試劑盒（上海華瞬生物工程有限公司）從大腸桿菌JM109提取重組質(zhì)粒pMD18－T－PLFN。從干酪乳桿菌Lactobacillus casei 393中提取質(zhì)粒pPG612.1，按Anderson等方法從乳酸菌中提取質(zhì)粒[7－8]。將干酪乳桿菌表達載體pPG612.1和重組質(zhì)粒pMD18－T－PLFN分別進行SacⅠ、XholⅠ雙酶切，結(jié)果見表1。

置于37℃水浴反應4 h。1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果。然后分別對目的片段用柱式膠回收試劑盒（上海華瞬生物工程有限公司）分別回收3 500 bp的載體片段和1 000 bp的基因片段。

表1 酶切體系Table 1 Reaction system of restriction enzyme（μL）

1.7 PLFN基因干酪乳桿菌表達載體的構(gòu)建

1.7.1 雙酶切純化產(chǎn)物的連接

將1.6制備的雙酶切純化產(chǎn)物進行連接。連接反應體系為粘性末端pPG612.1 5 μL，10×T4Ligase buffer 2 μL，T4DNA Ligase 1 μL，ddH2O 2 μL，粘性末端S基因10 μL，將連接反應體系混勻。置于連接儀中16℃連接過夜；連接產(chǎn)物將用于轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞。在LB瓊脂平板上挑取菌落接種于 5 mL 含 10 μg·mL－1氯霉素（Cm）的LB 液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)過夜，按《分子克隆實驗指南》的堿裂解法小劑量制備質(zhì)粒的步驟提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行Sac I單酶切，Sac I、Xhol I雙酶切鑒定，同時進行PCR鑒定。將重組質(zhì)粒命名為pPG612－ PLFN。

1.7.2 電轉(zhuǎn)化用干酪乳桿菌感受態(tài)細胞的制備及電轉(zhuǎn)化

乳酸桿菌ATCC393、KLDS1.0677、KLDS1.0652及KLDS1.0413按照如下方法制備感受態(tài)細胞：挑取新鮮培養(yǎng)的單菌落，接種于5 mL MRS液體養(yǎng)基中，37℃過夜靜止培養(yǎng)；取過夜培養(yǎng)物5 mL，用MRS培養(yǎng)液稀釋至200 mL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD590為0.6左右；將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到預冷的500 mL離心管中，冰上放置10 min；4℃，5 000 r·m－1離心15 min，用50 mL冰冷的EPWB緩沖液洗滌3次；用50 mL冰冷的EPB溶液洗滌1次；用2 mL冰冷的電轉(zhuǎn)化緩沖液懸浮；分裝每管100 μL。制備好的感受態(tài)細胞可以使用，并放入－70℃冰箱中待用。

將重組質(zhì)粒pPG612－PLFN分別與電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞混勻后，冰上放置5 min；將其轉(zhuǎn)入2 mm的預冷電轉(zhuǎn)化杯（Bio－Rad公司）中；以Transformation Apparatus 165－2101電擊，參數(shù)為電壓2.5 kV，電擊時間約為5 ms；電擊后加入450 μL冰預冷的MRS培養(yǎng)基，混勻；將菌液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，冰上放置10 min；37℃厭氧培養(yǎng)2 h；取適量菌液涂布于含有 10 μg·mL－1Cm的MRS瓊脂培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)2～3 d。

1.7.3 陽性重組質(zhì)粒的鑒定

分別于各平板上挑取單菌落，分別接種于含有10 μg·mL－1Cm的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)過夜后，按1.6方法提取質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行Bam H I單酶切，Sac I、Xhol I雙酶切鑒定，同時進行PCR鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMD18-T-PLFN的鑒定

如圖1可知，重組質(zhì)粒pMD18－T－PLFN用Bam H I單酶切后得到大小約為3 600 bp的基因片段，用Sac I、Xhol I雙酶切后得到大小約為1 000和2 600 bp基因片段，以P1、P2為引物進行PCR擴增，得到約為1 000 bp基因片段，與預計大小相符合。表明PLFN基因片段插入到克隆載體pMD18－T中。

圖1 pMD18-T-PLFN 重組質(zhì)粒鑒定Fig.1 Identification of recombinant plasmid pMD18-T-PLFN

測序結(jié)果表明獲得大小為1 077 bp的PLFN基因與預期相符，通過與GenBank上已發(fā)表的序列相比對，結(jié)果表明本研究獲得的長白豬PLFN基因與GenBank 序列 AY306198.1、M81327.1、L77887.1及M92089.1的核苷酸同源性分別達99.16%，99.07%，99.63%和99.35%，可見PLFN基因在核苷酸序列上高度保守。

2.2 pPG612-PLFN基因干酪乳桿菌表達載體構(gòu)建鑒定的結(jié)果

如圖2所示，重組質(zhì)粒pPG612－PLFN單酶切后得到大小為4 600 bp的片段，用SacⅠ、XholⅠ雙酶切后得到大小約為1 000和3 600 bp片段。以P1、P2為引物進行PCR擴增，得到約為1 000 bp基因片段，與預計大小相符合。表明PLFN基因片段已插入到表達載體pPG612.1中。

圖2 pPG611.1-Sa質(zhì)粒的酶切及PCR鑒定Fig.2 Restriction enzyme and PCR analysis of recombinant plasmid pPG611.1-Sa

2.3 表達載體重組質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜

結(jié)果見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pPG612-PLFN 構(gòu)建圖譜Fig.3 Constructed map of recombinant plasmid pPG612-PLFN

序列測定結(jié)果表明，PLFN基因已成功插入到表達載體質(zhì)粒pPG612.1的Sac I與Xhol I酶切位點之間，pPG612－PLFN/Lactobacillus casei 393為分泌表達的載體系統(tǒng)，表達蛋白將大部分分泌于培養(yǎng)菌體的上清液中。

2.4 重組乳酸菌的構(gòu)建結(jié)果

將重組質(zhì)粒pPG612－PLFN轉(zhuǎn)化入各種干酪乳桿菌后，各重組乳酸菌的構(gòu)建結(jié)果見圖4～7。由圖可見，PCR擴增均獲得約1 000 bp的PLFN基因片段，Sac I、Xhol I雙酶切分析均獲得約1 000 bp的目的基因片段和約3 600 bp的表達載體片段，表明已獲得轉(zhuǎn)化了豬乳鐵蛋白N端基因的四種重組乳酸菌，分別為Lactobacillus casei ATCC393，Lactobacillus plantarum KLDS1.0677，Lactobacillus paracasei KLDS1.0652，Lactobacillus pentosus KLDS 1.0413。

圖4 重組副干酪乳桿菌KLDS1.0652鑒定Fig.4 Identification of recombinant Lactobacillus paracasei KLDS1.0652

圖5 重組植物乳桿菌KLDS1.0344鑒定Fig.5 Identification of recombinant Lactobacillus plantarum KLDS1.0344

圖6 重組干酪乳桿菌ATCC393鑒定Fig.6 Identification of recombinant Lactobacillus casei ATCC393

圖7 重組戊糖乳桿菌KLDS1.0413鑒定Fig.7 Identification of recombinant Lactobacillus pentosus KLDS1.0413

3 討論與結(jié)論

干酪乳桿菌作為表達和傳遞外源基因的載體系統(tǒng)具有益生性、安全性，以及可以通過先天性免疫激活腸道黏膜免疫系統(tǒng)，不會刺激體產(chǎn)生抗體等重要特點[9]，尤其是分泌型載體表達的外源蛋白無需純化，近年來受到越來越多的重視。在表達動物的病原基因作為黏膜免疫的口服疫苗以及一些安全級食品添加劑上日趨成熟。鑒于乳桿菌種類多（50多種），而不同乳桿菌生化特性、生態(tài)及分子構(gòu)成的不同[10]，本研究在乳酸菌的宿主菌選擇上，除用了干酪乳桿菌ATCC393外，另選用了同是乳桿菌的植物乳桿菌、副干酪乳桿菌和戊糖乳桿菌。其中植物乳桿菌由于發(fā)酵斷奶仔豬料具有適口性好、易消化吸收等優(yōu)良特點，同時能給斷奶仔豬提供一定的乳酸和有益菌，抑制有害菌的繁殖，從而可以緩解斷奶腹瀉和提高抗病力等特性[11－12]。Nemcova等報道副干酪乳桿菌可顯著降低剛斷奶幼豬體內(nèi)梭菌屬和腸桿菌的數(shù)量[13]；已有研究表明[14]，戊糖乳桿菌本身作為為活菌制劑，可抑制有害菌群的生長繁殖，促進有益菌在動物的腸道內(nèi)定植，從而可防治仔豬腹瀉。

乳鐵蛋白是在多種哺乳動物如人類、猴、牛和豬的乳汁中含有的一種帶正電荷的糖蛋白，是由一條帶有兩個鐵離子結(jié)合區(qū)域的肽鏈折疊而成，分子量在不同動物有所區(qū)別，大約是72～85 ku之間。乳鐵蛋白能夠刺激機體產(chǎn)生系統(tǒng)性和黏膜免疫防御而抑制和殺死細菌，作為免疫刺激劑，乳鐵蛋白可以改進免疫功能和加強宿主的防御系統(tǒng)，減少斷乳仔豬疾病感染和斷乳應激反應的發(fā)生[15－16]。Wu等的研究認為[17]，乳鐵蛋白可能是在家畜飼養(yǎng)上一種非常重要的抗生素替代品。豬乳鐵蛋白研究者發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白的許多功能都與乳鐵蛋白N－葉密切相關(guān)，而且乳鐵蛋白肽（Lctoferricin,Lfcin），被認為是乳鐵蛋白的抗菌活性中心）也位于乳鐵蛋白N－葉。Lfcin是乳鐵蛋白在消化道內(nèi)經(jīng)酸性胃蛋白酶水解后的小肽[18]，位于乳鐵蛋白N－葉中的17～42氨基酸殘基之間，具有廣譜抗細菌、抗病毒和抗真菌活性，還是乳鐵蛋白與淋巴細胞表面受休和細菌表面LPS結(jié)合的部位。因此為了在基因工程中有效表達豬乳鐵蛋白，本研究選用豬乳鐵蛋白N端基因序列作為靶基因，N端序列乳酸菌表達載體的成功構(gòu)建，為研究豬乳鐵蛋白的抗菌活性機制及近一步在體內(nèi)應用發(fā)揮其廣譜的抑菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)作用等生物學功能奠定基礎。

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