有氧運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞增殖／凋亡的影響及其機(jī)制探討

田振軍，蔡夢昕，邢維新

有氧運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞增殖／凋亡的影響及其機(jī)制探討

田振軍1，蔡夢昕1，邢維新2

目的：探討有氧運(yùn)動(dòng)對大鼠心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制。方法：選取3月齡雄性SD大鼠30只，體重180～220g。隨機(jī)分為正常對照組和有氧運(yùn)動(dòng)組，每組15只。正常對照組大鼠常規(guī)籠內(nèi)生活，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行8wk有氧運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)以15m／min的速度開始，運(yùn)動(dòng)20min后，以3m／min的遞增速度逐漸遞增至20m／min，并增加跑臺(tái)坡度至5°，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60min，5d／1wk×8wk。訓(xùn)練結(jié)束后，測定HR、LVSP、LVEDP和± dp／dtmax等指標(biāo)，判定各組大鼠心功能變化；之后開胸摘取心臟，進(jìn)行組織學(xué)制片、Masson染色和心肌細(xì)胞分離與激光共聚焦顯微鏡觀察；免疫組織化學(xué)法觀察分析干細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白c－kit及其配體SCF，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl－2和p53蛋白表達(dá)；Western Blotting法分析細(xì)胞周期與細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白CyclinD2、CDK4和PCNA的表達(dá)。結(jié)果：與正常對照組相比，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠心系數(shù)均顯著增加（P＜0.05）；HR和LVEDP均顯著下降（P＜0.05），LVSP和±dp／dtmax均顯著升高（P＜0.05），雙核心肌細(xì)胞出現(xiàn)率顯著增加（P＜0.05），心肌組織中，c－kit和SCF的MOD值均顯著升高（P＜0.01），Bcl－2的MOD值顯著升高（P＜0.05），p53的MOD值顯著下降（P＜0.01），Bax的MOD值顯著下降（P＜0.05）；心肌組織CyclinD2和CDK4蛋白表達(dá)有升高趨勢，但無顯著性差異，PCNA蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。結(jié)論：證實(shí)了有氧運(yùn)動(dòng)可顯著提高大鼠心功能；證實(shí)了大鼠心肌細(xì)胞存在著增殖現(xiàn)象；有氧運(yùn)動(dòng)可抑制促凋亡因子的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡；發(fā)現(xiàn)了有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的增殖。有關(guān)運(yùn)動(dòng)影響心肌細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究。

心肌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；有氧運(yùn)動(dòng)；鼠；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

組織器官的增生與肥大一般包括細(xì)胞體積增大和數(shù)量增多。一直以來，人們普遍認(rèn)為，心肌細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，出生不久后退出細(xì)胞周期，喪失增殖能力。故運(yùn)動(dòng)性心臟肥大以心肌細(xì)胞體積增大為主，主要體現(xiàn)在耐力訓(xùn)練和力量訓(xùn)練的運(yùn)動(dòng)員心臟結(jié)構(gòu)的重塑上，而安靜狀態(tài)下的心功能變化不顯著［34］。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，正常生理和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下心肌細(xì)胞存在著凋亡現(xiàn)象［23］。從維持心肌細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡，穩(wěn)定心功能的角度，推測心肌細(xì)胞必然存在著增殖現(xiàn)象。目前研究證實(shí)，正常心臟存在著固有干（祖）細(xì)胞［14，37］，心肌細(xì)胞確有增殖能力［9，13，35，37］。盡管其增殖能力非常有限［8］，且更新率隨年齡增長而逐漸降低［9］，但在維持心功能穩(wěn)定和受損心肌恢復(fù)方面，具有極其重要的生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)意義。

已有研究表明，運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響，大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起心肌細(xì)胞凋亡顯著增加［1，3，17］，如果心肌細(xì)胞不具備增殖能力，那么，運(yùn)動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)將難以置信。因此推測，運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞增殖同樣具有一定的影響。目前，國內(nèi)外關(guān)于運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞增殖的研究報(bào)道極其有限，本研究僅從大鼠心功能、心肌細(xì)胞增殖相關(guān)因子及干細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白和細(xì)胞凋亡等相關(guān)指標(biāo)入手，探討有氧運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其可能機(jī)制，為運(yùn)動(dòng)性心肌肥大機(jī)制研究和運(yùn)動(dòng)防治心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Sprague Dawley 3月齡雄性大鼠30只，體重180～220g，購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理中心（動(dòng)物質(zhì)量合格證號：陜醫(yī)動(dòng)證字08－004號）。隨機(jī)分為對照組和有氧運(yùn)動(dòng)組，每組15只，分籠飼養(yǎng)，每籠6只。動(dòng)物室內(nèi)溫度20℃～29℃，相對濕度50%～60%，大鼠均采用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器為PowerLab／8s生理信號采集處理系統(tǒng)，ALC－V8動(dòng)物呼吸機(jī)，LEICA－RM 2126切片機(jī)，BM－Ⅱ型病理組織包埋機(jī)，生物組織攤烤片機(jī)，Leica TCS SP5激光共聚焦掃描顯微鏡，BX51奧林巴斯光學(xué)顯微鏡，低溫高速離心機(jī)、酶標(biāo)儀，Biorad電泳儀和轉(zhuǎn)移槽、凝膠成像儀等。主要試劑除常規(guī)試劑無水乙醇、二甲苯等外，Tween 20、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、兔抗小鼠、大鼠、人多克隆抗體SCF、Bcl－2、Bax和p53均購于武漢博士德生物工程有限公司，兔抗大鼠多克隆抗體PCNA購于北京博奧森生物有限公司，兔抗大鼠多克隆抗體CyclinD2、CDK4和c－kit均購于santa cruz公司，STDIn－AM熒光探針由本?；瘜W(xué)材料學(xué)院合成饋贈(zèng)。

1.3 動(dòng)物運(yùn)動(dòng)方案

安靜對照組正?；\內(nèi)生活，不運(yùn)動(dòng)。有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行為期8wk的小動(dòng)物跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，初始速度為15m／min，運(yùn)動(dòng)20min后，以3m／min的增速逐漸遞增至20m／min，并增加跑臺(tái)坡度至5°，共運(yùn)動(dòng)60min，5d／1wk×8wk［2］。

1.4 心系數(shù)和血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)測定

8wk實(shí)驗(yàn)后次日上午，大鼠稱重麻醉后，經(jīng)右頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室，以多導(dǎo)生理記錄儀測試心率（HR）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室壓力最大上升速率（＋dp／dtmax）和最大下降速率（－dp／dt max）等心功能指標(biāo)。數(shù)據(jù)采集完畢后，迅速開胸摘取心臟，生理鹽水沖洗淤血，濾紙吸干，稱取心臟重量，以心臟重量與體重比值計(jì)算心系數(shù)。

1.5 心臟樣品處理

每組隨機(jī)選取6只大鼠心臟，置10%中性甲醛溶液固定24h后，經(jīng)流水沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，石蠟包埋。連續(xù)切片（厚5μm），常規(guī)制片，Masson染色。另取6只大鼠心臟鋁箔紙包裹，液氮冷凍24h后，移至－80℃低溫冰箱保存，用于Western Blotting實(shí)驗(yàn)。

1.6 心肌細(xì)胞分離與觀察

離體心臟經(jīng)主動(dòng)脈插管進(jìn)行Ⅰ型－膠原酶灌流，分離心肌細(xì)胞，STDIn－AM負(fù)載，用于標(biāo)記心肌細(xì)胞胞漿和胞核，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察［2］，計(jì)算心肌細(xì)胞雙核出現(xiàn)百分率。

1.7 免疫組化實(shí)驗(yàn)

切片嚴(yán)格按照SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。切片脫蠟至水，PBS液清洗，3%H2O2浸泡10 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶，PBS清洗，正常山羊血清封閉液37℃孵育30min以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，甩去血清，用一抗（c－kit、SCF、Bax、Bcl－2和P53抗體，均為1∶60）兔抗大鼠多克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS沖洗5次，二抗為生物素標(biāo)記的山羊抗兔抗體（1∶200）37℃孵育30 min，PBS沖洗5次，SABC復(fù)合物37℃孵育30min，PBS沖洗5次，DAB顯色，蒸餾水洗滌終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹膠封片。每次染色設(shè)置空白對照（PBS取代一抗和二抗）及陰性對照（PBS取代一抗）。采用Olympus顯微圖像分析系統(tǒng)觀察，低倍鏡選位，400倍鏡下拍照。

1.8 CyclinD2、CDK4和PCNA的Western Blotting實(shí)驗(yàn)

采用Western Blotting法測定CyclinD2、CDK4和PCNA蛋白表達(dá)，其常規(guī)程序?yàn)椋?0%～12%Tris－甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。CyclinD2、CDK4和PCNA一抗稀釋濃度分別為1∶500、1∶300和1∶800。

1.9 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

組織切片經(jīng)Olympus光鏡觀察，Image－Pro Plus5.1軟件采集圖像。Western Blotting所得膠片采用ImageQuant TL軟件進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5.0Demo軟件轉(zhuǎn)換作圖。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行處理，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性差異分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.001為差異極顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 心系數(shù)和心功能參數(shù)的變化

與安靜對照組大鼠比較，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠體重顯著下降（P＜0.01），心臟重量和心系數(shù)均顯著升高（P＜0.05，表1）；HR和LVEDP顯著下降（P＜0.05），LVSP和±dp／dtmax均顯著升高（P＜0.05，表2）。

表1 大鼠體重、心重及心系數(shù)變化一覽表Table 1 The Body Weight，Heart Weight and Heart Coefficient Changes in Rats

表2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化一覽表Table 2 The Comparsion of Different Index of Hemodynamic in Rats

2.2 組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果

Masson染色顯示，對照組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，胞漿呈紫紅色，區(qū)分顯著，偶見雙核心肌細(xì)胞；有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰，肌纖維和細(xì)胞核大小勻稱，排列較對照組更緊密整齊，偶見雙核心肌細(xì)胞，且出現(xiàn)率多于對照組。激光共聚焦掃描顯微鏡下可見，心肌細(xì)胞胞漿呈淺綠色，胞核呈綠色，兩組雙核心肌細(xì)胞明顯，且有氧運(yùn)動(dòng)組出現(xiàn)率多于對照組（圖1A－C和圖2A）。

2.3 c－kit、SCF、Bcl－2、Bax和p53表達(dá)的免疫組化觀察結(jié)果

光鏡下可見，c－kit、SCF、Bcl－2、Bax和p53在各組心肌組織中均有表達(dá)，陽性顆粒主要表達(dá)于心肌細(xì)胞膜和細(xì)胞漿部位。與對照組比較，有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌組織c－kit和SCF及Bcl－2的MOD值顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），p53和Bax的MOD值顯著下降（P＜0.01，P＜0.05；表3、圖2B～F）。

圖1 大鼠心肌細(xì)胞熒光染色圖Figure 1. Fluorescence staining of rat myocardial cells

表3 大鼠心肌組織c－kit、SCF、Bcl－2、Bax和p53表達(dá)的MOD比較一覽表Table 3 The Comparation of MOD Expression of the c－kit、SCF、Bcl－2、Bax and p53in Rat Myocardium

圖2 大鼠心肌組織Masson染色，c－kit、SCF、Bcl－2、Bax和p53蛋白表達(dá)的免疫組化圖Figure 2. Masson dyeing and Immunohistochemical Results of the Expression of c－kit，SCF，Bcl－2，Bax and p53in Rat Myocardium

2.4 CyclinD2、CDK4和PCNA蛋白表達(dá)的Western Blotting結(jié)果

Western Blotting結(jié)果表明，與對照組比較，有氧運(yùn)動(dòng)組大鼠心肌CyclinD2和CDK4蛋白表達(dá)有升高趨勢，但無顯著性差異。PCNA蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.01，圖3）。

圖3 大鼠心肌CyclinD2、CDK4和PCNA蛋白表達(dá)圖Figure 3. Results of Protein Expression of CyclinD2，CDK4and PCNA in Rat Myocardium

3 分析與討論

過去研究認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能等會(huì)產(chǎn)生良好影響。近年來，關(guān)于該方面的討論重新被關(guān)注，內(nèi)容涉及到運(yùn)動(dòng)項(xiàng)目、生活方式、體力活動(dòng)和營養(yǎng)對心臟形態(tài)結(jié)構(gòu)、整體功能和分子機(jī)制的研究［6，18，28，41，44］。Pluim BM等通過Meta分析表明，耐力和力量訓(xùn)練運(yùn)動(dòng)員心臟結(jié)構(gòu)變化差異顯著，而安靜狀態(tài)下的心功能無顯著差異［34］。本研究結(jié)果證實(shí)，8周有氧訓(xùn)練后，大鼠心系數(shù)顯著增加，HR和LVEDP顯著下降，LVSP和±dp／dtmax顯著升高，表明有氧訓(xùn)練使心臟發(fā)生適應(yīng)性肥大，提高了左室舒縮功能。

在胚胎及胎兒心肌細(xì)胞增殖和終末分化過程中，細(xì)胞增殖是心臟增長的主要手段。出生后，心肌細(xì)胞的有絲分裂方式由胞質(zhì)分裂（增殖）轉(zhuǎn)向胞核分裂（終末分化）。Jonker等報(bào)道，山羊出生后超過50%的心肌細(xì)胞進(jìn)行著胞核分裂，隨著生長發(fā)育，單核細(xì)胞總數(shù)開始下降，雙核細(xì)胞數(shù)量迅速增加［22］。本研究結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)大鼠雙核心肌細(xì)胞顯著高于安靜對照組，表明心肌細(xì)胞增殖的胞核分裂顯著性增加。文獻(xiàn)報(bào)道，人的生長過程中心肌細(xì)胞會(huì)緩慢更新，且隨年齡下降；心肌細(xì)胞和非心肌細(xì)胞存在多次更新［9，24］。心肌細(xì)胞能夠被NRG1／ErbB4信號誘導(dǎo)激活，發(fā)生心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌再生和心功能的改善［10］。細(xì)胞周期的激活是細(xì)胞增殖的關(guān)鍵。細(xì)胞周期的G1期進(jìn)入與CDKs時(shí)相性激活是細(xì)胞進(jìn)行分裂的關(guān)鍵，CyclinD家族是其關(guān)鍵調(diào)控蛋白，CyclinD2是細(xì)胞由靜止期進(jìn)入細(xì)胞周期的重要調(diào)控蛋白［12，36，42］。CyclinD2可激活CDK4／6，進(jìn)而激活下游誘導(dǎo)心肌細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞增殖［15］。小鼠心梗后CyclinD2蛋白過表達(dá)，促使心肌再生［33］。由此可見，CyclinD2對心肌細(xì)胞周期的激活以及心肌的再生具有重要意義。目前，關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)對心肌組織CyclinD2及CDK4表達(dá)的影響報(bào)道少見。本研究結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)使大鼠心肌CyclinD2和CDK4蛋白表達(dá)有升高趨勢，說明有氧運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)有一定作用。PCNA的表達(dá)標(biāo)志著DNA合成和細(xì)胞周期的進(jìn)程，是細(xì)胞增殖的標(biāo)記蛋白［11，19］。本研究結(jié)果顯示，PCNA蛋白表達(dá)均顯著升高，表明有氧運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞周期產(chǎn)生影響。但有氧運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的心肌肥大是否包含著心肌細(xì)胞數(shù)量的增多，即心肌細(xì)胞增殖現(xiàn)象，有待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

隨著干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，研究認(rèn)為，進(jìn)入細(xì)胞周期的心肌細(xì)胞除了心臟本身的功能心肌細(xì)胞外，心肌固有干細(xì)胞及外周趨化的成體干細(xì)胞是其增殖的另一個(gè)來源。研究發(fā)現(xiàn)，心臟中存在著固有干細(xì)胞巢，可表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白c－kit、sca－1或MOR－1等，有分化成為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的潛能［5，7，40］；心肌損傷后，心肌祖細(xì)胞被激活，可分化為新的心肌細(xì)胞［4］。而其他成體干細(xì)胞如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和造血干細(xì)胞，在特定微環(huán)境誘導(dǎo)下，也可成為心肌細(xì)胞增殖的來源［21，32，43］。c－kit在骨髓造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞和心肌干細(xì)胞等多種干細(xì)胞上均有表達(dá)，是經(jīng)典的干細(xì)胞表面標(biāo)志之一。SCF作為c－kit的配體，在正常心臟中有基礎(chǔ)性表達(dá)，在細(xì)胞存活、增殖與分化過程中起著重要作用［38］。SCF和其他細(xì)胞因子一起，可誘導(dǎo)干細(xì)胞或祖細(xì)胞的動(dòng)員、增生和延長其存活期［31］。目前，關(guān)于運(yùn)動(dòng)促進(jìn)心肌干細(xì)胞的動(dòng)員、增殖和分化的報(bào)道少見。本研究結(jié)果表明，有氧運(yùn)動(dòng)可使心肌組織c－kit和SCF蛋白表達(dá)顯著增加。而c－kit＋細(xì)胞可能是內(nèi)皮祖細(xì)胞或造血干細(xì)胞，也可能是心臟固有干細(xì)胞，提示有氧運(yùn)動(dòng)可提高干細(xì)胞的動(dòng)員能力，促進(jìn)干細(xì)胞數(shù)目的增加，為促進(jìn)細(xì)胞增殖與分化提供了細(xì)胞來源。

文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷與心肌細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。過度超負(fù)荷與物理牽張和力竭運(yùn)動(dòng)刺激均可導(dǎo)致大鼠心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，且隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的加大細(xì)胞凋亡顯著上升［1，3，16，17，29］，適宜運(yùn)動(dòng)負(fù)荷可抑制心肌細(xì)胞凋亡［25，46］。影響心肌細(xì)胞凋亡的因素包括ROS、Ca2＋、Cyt C、NO以及神經(jīng)遞質(zhì)和激素等。研究證實(shí)，長期適宜運(yùn)動(dòng)可減輕衰老和高血壓引起的心肌細(xì)胞凋亡［16，26，27］；運(yùn)動(dòng)通過心肌線粒體途徑抵抗缺血再灌注引起的細(xì)胞凋亡，對心肌產(chǎn)生保護(hù)作用［25，40］。Bax、Bcl－2和p53在心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用，長期中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起心肌細(xì)胞Bcl－2mRNA表達(dá)顯著增加，抑制心肌細(xì)胞凋亡［3］；而過度訓(xùn)練參與運(yùn)動(dòng)性心肌細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程［1］。p53是缺血缺氧損傷中的關(guān)鍵調(diào)控因子，p53蛋白表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［20］。本研究實(shí)驗(yàn)證實(shí)，有氧運(yùn)動(dòng)可使大鼠心肌細(xì)胞Bcl－2蛋白表達(dá)升高，p53和Bax蛋白表達(dá)顯著降低，表明有氧運(yùn)動(dòng)可抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

機(jī)體從發(fā)育期開始，細(xì)胞凋亡與增殖就是兩個(gè)緊密相聯(lián)的過程。心肌細(xì)胞凋亡往往代表心功能的適應(yīng)性改變，細(xì)胞凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡對穩(wěn)定心功能具有重要意義。當(dāng)心功能處于提升階段時(shí)，心肌細(xì)胞增殖大于凋亡，當(dāng)老年心臟的心功能處于下降階段時(shí)，心肌細(xì)胞凋亡大于增殖。一般認(rèn)為，心肌細(xì)胞的增殖與凋亡屬于共變現(xiàn)象，非因果關(guān)系。細(xì)胞增殖和凋亡過程通過細(xì)胞因子相關(guān)聯(lián)。但近年來發(fā)現(xiàn)，Bcl－2和p53表達(dá)與心肌細(xì)胞增殖關(guān)系密切。Bcl－2過表達(dá)可引起心肌細(xì)胞有絲分裂率顯著增加，p53及p53依賴基因下調(diào)。推測Bcl－2過表達(dá)通過形成Mdm2－p53復(fù)合物，下調(diào)p53功能，降低心肌細(xì)胞CdkI p21水平，促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖［30］。p53磷酸化可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖蛋白的表達(dá)，p53釋放既引發(fā)凋亡也抑制細(xì)胞周期G1期進(jìn)入S期［39］。在有氧運(yùn)動(dòng)引起心肌肥大的過程中，存在著細(xì)胞凋亡和增殖現(xiàn)象。推測：通過增加抗氧化酶活性，抑制氧自由基誘導(dǎo)的心肌凋亡蛋白的表達(dá)，降低心肌線粒體釋放活性氧誘導(dǎo)的細(xì)胞色素C，抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并增加心肌細(xì)胞對細(xì)胞凋亡的耐受性；增加循環(huán)系統(tǒng)中骨髓干細(xì)胞的數(shù)量，并提高其遷移能力，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖；促進(jìn)與心肌細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)水平，激活細(xì)胞增殖信號通路，使心肌固有干細(xì)胞或骨髓干細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖。此外，適宜的有氧運(yùn)動(dòng)通過對血管再生、側(cè)支循環(huán)建立和缺氧狀態(tài)的改善，包括神經(jīng)調(diào)控和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，改善心功能。成體心肌細(xì)胞表型雖為終末分化型，但存在著干細(xì)胞的瞬息增殖，通過胞漿分裂和胞核分裂等細(xì)胞增殖方式實(shí)現(xiàn)單核和雙核心肌細(xì)胞的數(shù)量增加和體積增大，瞬時(shí)彌補(bǔ)心肌細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞數(shù)量的減少，但如何促進(jìn)單核心肌細(xì)胞數(shù)量的增加還需要進(jìn)一步研究。

截止目前，關(guān)于運(yùn)動(dòng)性心肌肥大機(jī)制研究，主要集中于心肌實(shí)質(zhì)成分與間質(zhì)成分的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)與分子生物學(xué)等方面，而對心肌細(xì)胞的發(fā)育生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的研究報(bào)道尚少；心肌梗死后增加心肌細(xì)胞數(shù)量是全面改善和治療該病的根本，目前的干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化與移植還存在諸多問題，如不能長期存活，具有排異反應(yīng)和成瘤性等問題。有文獻(xiàn)報(bào)道，有氧運(yùn)動(dòng)可有效改善心肌梗死心臟心功能［45］，但是否通過心肌細(xì)胞增殖途徑，文獻(xiàn)尚少見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的增殖，該結(jié)果將為運(yùn)動(dòng)性心肌肥大機(jī)制研究和運(yùn)動(dòng)防治心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)了有氧運(yùn)動(dòng)可顯著提高大鼠心功能；證實(shí)了大鼠心肌細(xì)胞存在著增殖現(xiàn)象；有氧運(yùn)動(dòng)可抑制促凋亡因子的表達(dá)，抑制心肌細(xì)胞凋亡；發(fā)現(xiàn)有氧運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖相關(guān)因子的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的增殖。有關(guān)運(yùn)動(dòng)影響心肌細(xì)胞增殖與凋亡的分子機(jī)制，有待于進(jìn)一步深入研究。

［1］常蕓，袁箭峰，祁永梅，等.運(yùn)動(dòng)心臟重塑與微損傷發(fā)生中的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象［J］.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2003，22（4）：344－349.

［2］田振軍，米春娟，張小玲，等.有氧運(yùn)動(dòng)對大鼠心肌活細(xì)胞核鈣轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2008，24（02）：191－195.

［3］張鈞，陳曉鶯，許豪文.運(yùn)動(dòng)對心肌細(xì)胞中凋亡調(diào)控基因表達(dá)影響［J］.體育科學(xué)，2005，25（8）：79－82.

［4］ANGERT D，BERRETTA RM，KUBO H，et al.Repair of the injured adult heart involves new myocytes potentially derived from resident cardiac stem cells［J］.Circ Res，2011，108（10）：1226－1237.

［5］ANVERSA P，KAJSTURA J，LERI A，et al.Life and Death of Cardiac Stem Cells：A Paradigm Shift in Cardiac Biology［J］.Circulation，2006，113（11）：1451－1463.

［6］BAGGISH A L，WOOD M J.Athlete＇s heart and cardiovascular care of the athlete：scientific and clinical update［J］.Circulation，2011，123（23）：2723－2735.

［7］BELTRAMI A P，BARLUCCH L，TORELLA D，et al.Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration［J］.Cell，2003，114（6）：763－776.

［8］BELTRAMI A P，URBANEK K，KAJSTURA J，et al.Evidence that human cardiac myocytes divide after myocardial infarction［J］.N Engl J Med，2001，344（23）：1750－1757.

［9］BERGMANN O，BHARDWAJ R D，BERNARD S，et al.Evidence for cardiomyocyte renewal in humans［J］.Sci，2009，324（5923）：98－102.

［10］BERSELL K，ARAB S，HARING B，et al.Neuregulin1／ErbB4 signaling induces cardiomyocyte proliferation and repair of heart injury［J］.Cell，2009，138（2）：257－270.

［11］BRAVO R，F(xiàn)RANK R，BLUNDELL P A，et al.Cyclin／PCNA is the auxilliary protein of DNA polymerase－delta［J］.Nature，1987，326（6112）：515－517.

［12］BRYJA V，PACHERNíK J，VONDRáCEK J，et al.Lineage specific composition of cyclin D－CDK4／6－p27complexes reveals distinct functions of CDK4，CDK6and individual D－type cyclins in differentiating cells of embryonic origin［J］.Cell Prolif，2008，41（6）：875－893.

［13］BUJA L M，VELA D.Cardiomyocyte death and renewal in the normal and diseased heart［J］.Cardiovasc Pathol，2008，17（6）：349－374.

［14］BU L，JIANG X，MARTIN－PUIG S，et al.Human ISL1heart progenitors generate diverse multipotent cardiovascular cell lineages［J］.Nature，2009，460（7251）：113－117.

［15］BUSK P K，HINRICHSEN R，BARTKOVA J，et al.CyclinD2 induces proliferation of cardiac myocytes and represses hypertrophy［J］.Exp Cell Res，2005，304（1）：149－161.

［16］CARRARO U，F(xiàn)RANCESCHI C.Apoptosis of skeletal and cardiac muscles and physical exercise［J］.Aging（Milano），1997，9（1－2）：19－34.

［17］CHEN T I，SHEN Y J，WANG I C，et al.Short－term exercise provides left ventricular myocardial protection against intermittent hypoxia－induced apoptosis in rats［J］.Eur J Appl Physiol，2011，111（8）：1939－1950.

［18］GIELEN S，SCHULER G，ADAMS V.Cardiovascular effects of exercise training：molecular mechanisms［J］.Circulation，2010，122（12）：1221－1238.

［19］GUDE N A，EMMANUEL G，WU W，et al.Activation of Notch－mediated protective signaling in the myocardium［J］.Circ Res，2008，102（9）：1025－1035.

［20］HAMMOND E M，GIACCIA A J.The role of P53in hypoxiainduced apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Communi，2005，331（3）：718－725.

［21］JACKSON K A，MAJKA S M，WANG H，et al.Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stem cells［J］.J Clin Invest，2001，107（11）：1395－1402.

［22］JONKER S S，ZHANG L，LOUEY S，et al.Myocyte enlargement，differentiation，and proliferation kinetics in the fetal sheep heart［J］.J Appl Physiol.2007，102（3）：1130－1142.

［23］KAJSTURA J，CHENG W，SARANGARAJAN R，et al.Necrotic and apoptotic myocyte cell death in the aging heart of Fischer 344rats［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，1996，271（3Pt2）：H1215－1228.

［24］KAJSTURA J，URBANEK K，PERL S，et al.Cardiomyogenesis in the adult human heart［J］.Circ Res，2010，107（2）：305－315.

［25］KAVAZIS A N，MCCLUNG J M，HOOD D A，et al.Exercise induces a cardiac mitochon－drial phenotype that resists apoptotic stimuli［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2008，294（2）：H928－H935.

［26］KOLWICZ S C，MACDONNELL S M，RENNA B F，et al.Left ventricular remodeling with exercise in hypertension［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297（4）：H1361－H1368.

［27］KWAK H B，SONG W，LAWLER J M.Exercise training atten－uates age－induced elevation in Bax／Bcl－2ratio，apoptosis，and remodeling in the rat heart［J］.FASEB J，2006，20（6）：791－793.

［28］LA GERCHE A，PRIOR D L，HEIDBüCHEL H.Strenuous endurance exercise：is more better for everyone？Our genes won＇t tell us［J］.Br J Sports Med，2011，45（3）：162－164.

［29］LERI A，CLAUDIO PP，LI Q，et al.Stretch－mediated release of angiotensin II induces myocyte apoptosis by activating p53that enhances the local renin－angiotensin system and decreases the Bcl－2－to－Bax protein ratio in the cell［J］.J Clin Invest，1998，101（7）：1326－1342.

［30］LIMANA F，URBANEK K，CHIMENTI S，et al.bcl－2overexpression promotes myocyte proliferation［J］.Proc Nat Acad Sci USA，2002，99（9）：6257－6262.

［31］MAUCH P，LAMONT C，NEBEN TY，et al.Hematopoitetic stem cells in the blood after stem cell factor and interleukin－11 administration：evidence for different machanisms of mobilization［J］.Blood，1995，86（12）：4674－4680.

［32］ORLIC D，KAJSTURA J，CHIMENTI S，et al.Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart，improving function and survival［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（18）：10344－10349.

［33］PASUMARTHI K B，NAKAJIMA H，NAKAJIMA H O，et al.Targeted expression of CyclinD2results in cardiomyocyte DNA synthesis and infarct regression in transgenic mice［J］.Circ Res，2005，96（1）：110－118.

［34］PLUIM B M，ZWINDERMAN A H，VAN DER LAARSE A，et al.The athlete＇s heart.A meta－analysis of cardiac structure and function［J］.Circulation，2000，101（3）：336－344.

［35］PORRELLO E R，MAHMOUD A I，SIMPSON E，et al.Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart［J］.Sci，2011，331（6020）：1078－1080.

［36］SHERR C J.The Pezcoller lecture：cancer cell cycles revisited［J］.Cancer Res，2000，60（14）：3689－3695.

［37］SMART N，BOLLINI S，DUBéK N，et al.De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury［J］.Nature，2011，474（7353）：640－644.

［38］SMITH M A，COURT E L，SMITH J G.Stem cell factor：laboratory and clinical aspects［J］.Blood Rev，2001，15（4）：191－197.

［39］SWYNGHEDAUW B.Are Adult cardiocytes still able to proliferate［J］.Arch Mal Coeur，2003，96（12）：1225－1230.

［40］URBANEK K，TORELLA D，SHEIKH F，et al.Myocardial regeneration by activation of multipotent cardiac stem cells in ischemic heart failure［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（24）：8692－8697.

［41］VOLDERS P G.Marathon rat：myocardial remodeling in an animal model of vigorous endurance exercise and implications for humans［J］.Circulation，2011，123（1）：5－7.

［42］WANG Z，XIE Y，ZHANG L，et al.Migratory localization of CyclinD2－Cdk4complex suggests a spatial regulation of the G1－S transition［J］.Cell Struct Funct，2008，33（2）：171－183.

［43］WARD M R，STEWART D J，KUTRYK M J.Endothelial progenitor cell therapy for the treatment of coronary disease，acute MI，and pulmonary arterial hypertension：current perspectives［J］.Catheter Cardiovasc Interv，2007，70（7）：983－998.

［44］WEEKS K L，MCMULLEN J R.The athlete＇s heart vs.the failing heart：can signaling explain the two distinct outcomes［J］.Physiol（Bethesda），2011，26（2）：97－105.

［45］XU X，WAN W，POWERS A S，et al.Effects of exercise training on cardiac function and myocardial remodeling in post myocardial infarction rats［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，44（1）：114－122.

［46］ZHANG K R，LIU H T，ZHANG H F，et al.Long－term aerobic exercise protects the heart against ischemia／reperfusion injury via PI3kinase－dependent and Akt－mediated mechanism［J］.Apoptosis，2007，12（9）：1579－1588.

The Impact of Aerobic Exercise on Cardiomyocyte Proliferation／Apoptosis and Its Mechanism

TIAN Zhen－jun1，CAI Meng－xin1，XING Wei－xin2

Objectives：To discuss the influence of aerobic exercise on cardiomyocyte proliferation／apoptosis and its possible mechanism.Methods：Adult male Sprague－Dawley rats，weight about 180－220g，were assigned to 2groups equally：normal control group and aerobic exercise group.Control group rats had conventional cage life and aerobic exercise group rats made 8－week aerobic exercise.Exercise was initiated at 15m／min，for 20min.The speed and duration were gradually increased to 20m／min and 60min（including the 20min at 15m／min），5°incline for per session.The exercise was performed 5days per week for 8weeks.After 8weeks，to detect the cardiac function，we measured the changes in heart rate，LVSP，LVEDP，±dp／dtmax of the rats；After that，opened the thoracic and picked the heart for histologic section，Masson dyeing；Separated cardiomyocytes and observed by Laser Scanning Confocal Microscope；Stem cell factor（SCF），c－kit，Bax，Bcl－2as well as p53were assessed with immunohistochemistry；CyclinD2，CDK4，PCNA were assessed with Western blot analysis.Results：Compared to normal control group，heart coefficients，LVSP，LV dp／dtmax were all increased（P＜0.05）in exercise group rats.HR and LVEDP were all declined（P＜0.05）.Moreover，aerobic exercise made dual－core cardiomyocytes increase in the rat heart（P＜0.05）；Furthermore，aerobic exercise made the MOD of c－kit（P＜0.01），SCF（P＜0.01），Bcl－2（P＜0.05）increased significantly and Bax（P＜0.05），p53（P＜0.01）decreased significantly in the myocardium；With regard to cyclinD2and CDK4，there were no significance（P＞0.05）.In addition，PCNA（P＜0.01）were all increased.Conclusions：This paper confirmed the aerobic exercise could significantly improve cardiac function and the proliferation of myocardial cell；Aerobic exercise can inhibit the apoptosis of cardiomyocyte and found out that aerobic exercise could promote myocardial cell proliferation.The molecular mechanisms of exercise－induced of cardiac cell proliferation and apoptosis need further study.

cardiomyocyte；apoptosis；cellproliferation；aerobicexercise；rat；animalexperiments

G804.2

A

2011－09－02；

2012－02－14

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31040045，31171141）；陜西師范大學(xué)“211工程”—運(yùn)動(dòng)生物學(xué)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目。

田振軍（1965－），男，陜西綏德人，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心血管生物學(xué)，Tel：（029）85308092，E－mail：tianzj611＠hotmail.com；蔡夢昕（1987－），女，河南商丘人，在讀博士研究生，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生物學(xué)；邢維新（1983－），男，河南周口人，碩士，主要研究方向?yàn)檫\(yùn)動(dòng)心臟生物學(xué)。

1.陜西師范大學(xué) 體育學(xué)院 運(yùn)動(dòng)與心血管研究室，陜西西安710062；2.麗江師范高等?？茖W(xué)校體育系，云南麗江674100

1.Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China；2.Lijiang Teachers College，Lijiang 674100，China.

1000－677X（2012）03－0060－07

book=61,ebook=82