黑曲霉發(fā)酵法輔助提取芒萁黃酮及其抗氧化研究

曾 偉 丁利君 黃聰華 黎銀珠

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

黑曲霉發(fā)酵法輔助提取芒萁黃酮及其抗氧化研究

曾 偉 丁利君 黃聰華 黎銀珠

（廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006）

該試驗(yàn)旨在確定黑曲霉發(fā)酵法輔助提取芒萁黃酮的最佳提取工藝，并探討其抗氧化性。采用黑曲霉發(fā)酵法制備混合酶液的方法，通過單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)確定提取芒萁黃酮的最佳條件，并通過測(cè)定芒萁黃酮對(duì)羥基自由基、DPPH的清除作用和還原力的分析，對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，黑曲霉發(fā)酵法制備復(fù)合酶液，提取芒萁黃酮的最佳條件為加酶量2.5mL，pH 5.0，于70℃下酶解2h；黑曲霉產(chǎn)復(fù)合酶輔助提取率最高，由不加酶的6.66%提高到11.67%，芒萁黃酮提取物有良好的清除羥基自由基的能力。

芒萁；黃酮；黑曲霉；抗氧化

芒萁（dicranopteris linearis），又名鐵狼萁，是水龍骨目里白科芒萁屬的蕨類植物，廣泛分布于中國長江以南各省區(qū)。芒萁有很好的藥用價(jià)值，其根莖及葉可治凍傷，能清熱解毒，袪瘀消腫止血［1］。它含有糖類、有機(jī)酸、黃酮類、皂苷、強(qiáng)心苷、蒽醌類等有效成分，特別是總黃酮含量豐富。研究［2，3］表明，黃酮類化合物具有抗氧化、抗癌、防止心血管疾病、消炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒等作用。目前，提取黃酮類化合物的方法很多，如有機(jī)溶劑提取［4］、超聲波［5］、超臨界流體萃取［6，7］、微波法［8］、酶法［9，10］等，而未見發(fā) 酵法輔助提取黃酮的相關(guān)報(bào)道。該法通過微生物發(fā)酵法產(chǎn)生復(fù)合酶制劑，并以之分解植物細(xì)胞壁中的木質(zhì)素、纖維素等大分子物質(zhì)，促進(jìn)有效成分的浸出，相對(duì)超聲波、超臨界流體萃取、微波法而言，設(shè)備簡單，成本低。故本試驗(yàn)采用微生物發(fā)酵法輔助提取芒萁黃酮，優(yōu)化其提取工藝，分析其抗氧化活性，為芒萁資源的開發(fā)與利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

芒萁：采摘于廣州大學(xué)城。將新鮮芒萁去雜洗凈，于80℃烘干后粉碎，過80目篩，密封保存，備用。

蘆?。荷虾櫧莼瘜W(xué)試劑有限公司；

鄰苯三酚：分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠；

其他試劑：均為國產(chǎn)分析純；

黑曲霉：由廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；

固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：麩皮10g（250mL三角瓶），水15mL，參照文獻(xiàn)［11］制備。

1.2 主要儀器

雙光束紫外可見分光光度儀：TU－1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

微波消解儀：XT－9900型，上海新拓微波溶樣測(cè)試技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 制備混合酶液 斜面培養(yǎng)方法挑取黑曲霉斜面保藏菌種，接于斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，用無菌水將斜面上的孢子洗下。將1mL孢子懸液接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基，于600r／min 35℃條件下震蕩培養(yǎng)4d，50℃干燥48h，粉碎，過60目篩，制成粉狀干菌備用。稱取0.500g粉狀干菌，加20mL水溶解，磁力攪拌10min，用水定容至50mL，搖勻，在4℃下存放2d，過濾，得混合酶液，備用［12，13］。

1.3.2 總黃酮含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)［8］。

1.3.3 芒萁黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用 根據(jù)文獻(xiàn)［14］修改如下：在10mL試管中依次加入9mmol／L Fe2＋1mL，8.8mmol／L H2O21mL，搖勻，靜置10min；取不同濃度的樣品溶液2mL，搖勻，靜置10min，再加入9mmol／L水楊酸－乙醇溶液1mL，搖勻，靜置30min后，于510nm處測(cè)其吸光值，其清除率按式（1）計(jì)算：

式中：

E——羥基自由基的清除率，%；

A0——空白對(duì)照液的吸光值；

Ax——加入不同黃酮濃度樣品的溶液吸光值；

Aj——不加水楊酸的吸光值。

在文獻(xiàn)［14］的基礎(chǔ)上，式（1）中引入Aj是為了消除樣液本身對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。

1.3.4 芒萁黃酮對(duì)DPPH的清除作用 根據(jù)文獻(xiàn)［15］修改如下：取不同黃酮濃度的樣品（0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12mg／mL）1mL，與 0.5mmoL／mL 的 DPPH 溶 液0.25mL混合，加乙醇至10mL，在黑暗中37℃放置20min，在517nm 測(cè)定其吸光值A(chǔ)i；0.5mmol／mL DPPH 溶液0.25mL與1mL乙醇混合，搖勻，加乙醇至10mL，在黑暗中37℃放置20min，在517nm測(cè)定其吸光值A(chǔ)0；不同濃度樣品1mL與0.25mL乙醇混合，搖勻，加乙醇至10mL，在黑暗中37℃ 放置20min，在517nm測(cè)定其吸光值A(chǔ)j。以乙醇為空白調(diào)零。其抑制率按式（2）計(jì)算：

式中：

I—— 抑制率，%；

A0——空白對(duì)照液的吸光值；

Ai——加入不同濃度樣品的溶液吸光值；

Aj——樣液在測(cè)定波長的吸光值。

在文獻(xiàn)［15］的基礎(chǔ)上，在式（2）中引入Aj是為了消除樣液本身對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。

1.3.5 芒萁黃酮對(duì)還原力的影響 參照文獻(xiàn)［16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉發(fā)酵法提取芒萁黃酮的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)芒萁黃酮提取效果的影響 準(zhǔn)確稱量芒萁粉末5.0g，加入酶液2.5mL，無菌水100mL，pH 7，分別于23（室溫），30，40，50，60，70℃下浸提1.5h后，抽濾，定容至250mL，測(cè)定總黃酮含量，分析提取溫度對(duì)芒萁黃酮提取量的影響。由圖1可知，隨著浸提溫度的提高，芒萁黃酮的提取率逐漸增加；在60℃后，提取率增加幅度變小，以下試驗(yàn)選取60℃為提取溫度。

圖1 提取溫度對(duì)芒萁黃酮提取效果的影響Figure 1 The influence of the temperature of extraction of flavonoid from Dicranopteris linearis

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)芒萁黃酮提取效果的影響 準(zhǔn)確稱量芒萁粉末5.0g，加入酶液2.5mL，無菌水100mL，于pH 7，60℃下分別浸提0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，抽濾，定容至250mL，測(cè)定總黃酮含量，分析浸提時(shí)間對(duì)芒萁黃酮提取量的影響。由圖2可知，隨著浸提時(shí)間的增加，芒萁黃酮提取量也呈增加趨勢(shì)，但浸提時(shí)間超過1.5h后，增幅變小，以下處理中，均采用1.5h提取。

圖2 提取時(shí)間對(duì)芒萁黃酮提取率的影響Figure 2 The influence of the time of extraction of flavonoid from Dicranopteris linearis

2.1.3 酶液添加量對(duì)提取效果的影響 準(zhǔn)確稱量芒萁粉末5.0g，酶液添加量分別為0，15，20，25，30，35mL，無菌水100mL，于pH 7，60℃下浸提1.5h，抽濾，定容至250mL，測(cè)定總黃酮含量，確定加酶液的量對(duì)芒萁黃酮提取量的影響。由圖3可知，加入酶液，芒萁黃酮提取率增加；隨著加酶量的增加而增加，增加到1.5mL后，芒萁黃酮提取率的增幅逐漸減小。

2.1.4 pH值對(duì)芒萁黃酮提取效果的影響 準(zhǔn)確稱量芒萁粉末5.0g，加入無菌水100mL，分別調(diào)節(jié)pH 值至4，5，6，7，8，并加入黑曲霉酶液1.5mL于60℃下浸提1.5h，測(cè)定總黃酮含量，分析pH值對(duì)芒萁黃酮提取量的影響。由圖4可知，黑曲霉在pH值為5時(shí)，芒萁黃酮的提取量達(dá)到最高。

圖3 酶液量對(duì)芒萁黃酮提取效果的影響Figure 3 The inluence of enzyme volume on extraction of flavonoid from Dicranopteris linearis

圖4 pH值對(duì)芒萁黃酮提取效果的影響Figure 4 The influence of pH value on extraction of flavonoid from Dicranopteris linearis

2.2 黑曲霉提取芒萁黃酮正交試驗(yàn)及其結(jié)果

采用黑曲霉制備復(fù)合酶用于輔助提取芒萁黃酮，考慮到各因素之間的相互作用，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)提取溫度、浸提時(shí)間、加酶量、pH值進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，從中確定微生物輔助提取芒萁黃酮的最佳提取條件，因素水平見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels

由表2可知，最優(yōu)組合是A3B3C3D2，即溫度為70℃、加酶量為3.5mL、時(shí)間為2h、pH值為5.0。各因素對(duì)芒萁黃酮提取率的影響大小順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即提取溫度對(duì)芒萁黃酮提取率的影響比較大，主要是因?yàn)闇囟葘?duì)酶活有較大的影響。綜合考慮各方面的影響，pH值選擇5.0，加酶量為2.5mL，即最佳提取條件為加酶量2.5mL，pH 值5.0，于70℃酶解2h。黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)生的復(fù)合酶，具有多種活性較強(qiáng)的酶系，如纖維素酶、淀粉酶、果膠酶、蛋白酶等，可將原料中的纖維素等大分子化合物降解，從而破壞植物的細(xì)胞壁，促進(jìn)有效成分的提取。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，在溫度為70℃、加酶量為2.5mL、時(shí)間為2h、pH值為5.0的條件下，芒萁黃酮的提取率為11.67%。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Analyze and results of the L9（34）orthogonal array design

2.3 芒萁黃酮的抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 芒萁黃酮對(duì)·OH清除作用 由圖5可知，對(duì)羥基自由基的清除率隨著芒萁總黃酮的增加而增加，其IC50為1.22mg／mL。表明芒萁黃酮對(duì)清除羥基自由基具有較好的效果，有良好的抗氧化作用。

圖5 芒萁黃酮對(duì)羥基自由基的清除作用Figure 5 The influence of D.dichotoma flavonoids on·OH

2.3.2 芒萁黃酮對(duì)DPPH清除能力 由圖6可知，隨著芒萁黃酮濃度的增加，對(duì)DPPH清除能力隨之提高，芒萁黃酮表現(xiàn)出一定的對(duì)DPPH清除能力。

圖6 芒萁黃酮對(duì)DPPH的清除效果Figure 6 The influence of D.dichotoma flavonoids on DPPH

2.3.3 芒萁黃酮對(duì)還原能力的影響 由圖7可知，芒萁黃酮的還原力隨其濃度的增加而增加，表明芒萁黃酮有較強(qiáng)的給予電子的傾向，使自由基轉(zhuǎn)變成更穩(wěn)定的狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用。

圖7 芒萁黃酮對(duì)還原力的影響Figure 7 The effect of D.dichotoma flavonoids on reducing power

3 結(jié)論

采用黑曲霉發(fā)酵制取復(fù)合酶，輔助提取芒萁黃酮，不但可以有效提高黃酮得率，還可以大大降低生產(chǎn)成本，為芒萁的進(jìn)一步開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。芒萁黃酮有很好的抗氧化性。關(guān)于芒萁黃酮的具體結(jié)構(gòu)還需要進(jìn)一步研究探討。

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5 劉曉艷，白衛(wèi)東，溫玨晶.超聲輔助提取柿葉黃酮的工藝研究［J］.食品機(jī)械，2007，23（3）：70～72

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Study on extraction of flavonoids fromdicranopteris linearisassisted withAspergillusniger fermentation and its antioxidant research

ZENG Wei DING Li－jun HUANG Cong－h(huán)uaLI Yin－zhu

（School of Chemical Engineering and Light Industry，Guangdong University of Technology，Guangzhou，Guangdong510006，China）

The flavonoids ofdicranopteris lineariswas extracted with enzyme－assisted method of fermentation ofAspergillus，the optimum extraction process was determined，and its antioxidant activity was researched. Methods：the mixed enzyme was prepared withAspergillusfermentation，the best extraction conditions were determined by single－factor experiments and orthogonal test，and its antioxidant activity was analyzed.Results：the optimum extraction conditions were the amount of enzyme to 2.5mL，pH value of 5.0，at 70℃for 2h.Aspergillusenzyme－assisted extraction produced the highest rate，increased from 6.66%（without enzyme）to 11.67%，The flavonoids had good scavenging ability to hydroxyl radicals，and had good antioxidant activity and good prospects of development.

dicranopteris linearis；flavonoids；aspergillus；antioxidant

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.032

廣東省自然基金項(xiàng)目（編號(hào)：8151009001000029；10151009001000011）；廣東省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2008B021100013）

曾偉（1986－），男，廣東工業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：f12593006＠126.com

丁利君

2012－02－10