間接競爭酶聯(lián)免疫法檢測水樣中的重金屬鎘

王 津 生 威 王俊平 方淑兵

楊依錦 張曙光 王 碩

（天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

間接競爭酶聯(lián)免疫法檢測水樣中的重金屬鎘

王 津 生 威 王俊平 方淑兵

楊依錦 張曙光 王 碩

（天津科技大學(xué)食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

利用重金屬鎘多克隆抗體，建立一種低儀器成本的檢測水樣中重金屬鎘的間接競爭酶聯(lián)免疫法，其檢測限（IC15）為0.76μg／L，靈敏度（IC50）為11.33μg／L。交叉反應(yīng)結(jié)果表明，該抗體除與汞螯合物的交叉反應(yīng)率為10.9%，與其他金屬（錳，鉻，鎂，鐵，鉛，鎳，銀和銅）螯合物的交叉反應(yīng)率均低于1.32%。自來水和河水樣品中鎘的添加回收率為93.95%～107.40%，變異系數(shù)為3.97%～14.69%。

鎘；重金屬免疫學(xué)檢測法；多克隆抗體；酶聯(lián)免疫法；自來水；河水

鎘是一種毒性很強(qiáng)的重金屬，是人體非必需元素，它的半衰期超過10年［1，2］。鎘通過食物鏈被人體吸收后蓄積在肝、腎中，造成對人體的危害。日本發(fā)生的“骨痛病”就是由于鎘廢水污染土壤后轉(zhuǎn)移至農(nóng)產(chǎn)品中，通過食物鏈轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)而造成的。

目前用于檢測重金屬鎘離子的方法有原子吸收光譜法（AAS）、原子熒光法（AFS）、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP－AES）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICPMS）［3－6］，這些方法需要昂貴的儀器、專業(yè)的技術(shù)人員和復(fù)雜耗時(shí)的樣品處理過程，不適于快速現(xiàn)場檢測。重金屬免疫學(xué)檢測方法［7］與上述方法相比有著儀器成本低和適合現(xiàn)場檢測的優(yōu)點(diǎn)。

本試驗(yàn)建立了重金屬鎘離子的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法。為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)將其應(yīng)用于自來水和河水樣品的添加回收試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

標(biāo)準(zhǔn)鎘、汞、錳、鉻、鎂、鐵、鉛、鎳、銀溶液：中國科學(xué)計(jì)量研究院；

牛血清白蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、過氧化氫脲、3，3’，5，5’－四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、吐溫－20、二甲基亞砜（DMSO）、4－羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）：美國Sigma公司；

脫脂乳粉：美國BD公司；

HRP－標(biāo)記羊抗兔二抗：美國Promega公司；

β－環(huán)糊精：德國Merck公司；

乙二胺四乙酸（EDTA）：上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；

針對重金屬鎘的多克隆抗體、Cd－ITCBE－BSA包被原：本實(shí)驗(yàn)室自制

超純水儀：Milli－Q Avantage A10，美國 Milipore公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan Ascent，美國Thermo公司；

紫外分光光度計(jì)：UV－2450，日本島津公司；

96孔酶標(biāo)板：丹麥Nunc公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

本試驗(yàn)采用乙二胺四乙酸（EDTA）作為鎘的螯合劑，螯合方法如下：準(zhǔn)確量取1mL的1 000μg／mL的鎘標(biāo)準(zhǔn)品，與2.6mg等體積的EDTA（EDTA溶解在Hepes緩沖溶液中）進(jìn)行螯合，摩爾比為1∶1，然后使用三乙胺調(diào)節(jié)反應(yīng)物的pH至中性，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)16h，即形成500μg／mL的Cd－EDTA螯合物。

1.3 間接競爭酶聯(lián)免疫法的建立

包被原Cd－ITCBE－BSA用pH 9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋成0.004μg／孔，包被在96孔酶標(biāo)板上，100μL／孔，4℃孵育過夜。PBST洗板3次，每孔加入200μL封閉液（1%脫脂乳粉），室溫放置1h。PBST洗板3次，每孔加入50μL梯度稀釋的Cd－EDTA螯合物和50μL的抗體，室溫震蕩孵育1h。PBST洗板3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔，每孔100μL，室溫震蕩孵育30min。PBST洗板3次，加入底物液，每孔100μL，37℃顯色10min。加入終止液，每孔50μL。酶標(biāo)儀讀數(shù)。根據(jù)OD值按照式（1）計(jì)算抑制率：

式中：

IR—— 抑制率，%；

OD——加入標(biāo)準(zhǔn)品和抗體的吸光度值；

OD對照——不加標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值；

OD空白——不加標(biāo)準(zhǔn)品和抗體的吸光度值。

此繪制的抑制率曲線的X軸為Cd－EDTA濃度的對數(shù)值，Y軸為相應(yīng)的抑制率，并且標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀是典型的S型曲線。

1.4 交叉反應(yīng)

抗體與結(jié)構(gòu)類似化合物的交叉反應(yīng)程度，用交叉反應(yīng)率（CR%）表示。它是以抑制抗體最大結(jié)合率的50%所需目標(biāo)分析物的濃度IC50（Cd－EDTA）與所測各種結(jié)構(gòu)類似化合物的濃度IC50（其他金屬離子EDTA螯合物）之比的百分?jǐn)?shù)表示，按照式（2）計(jì)算交叉反應(yīng)率：

式中：

CR——交叉反應(yīng)率，%；

IC50（Cd－EDTA）—— 抑制率為50% 時(shí) Cd－EDTA的濃度，μg／L；

IC50（Metal－EDTA）—— 抑 制 率 為 50% 時(shí) 其 他 金 屬EDTA螯合物的濃度，μg／L。

交叉反應(yīng)率越小，則抗體特異性越高。本試驗(yàn)選擇汞、錳、鉻、鎂、鐵、鉛、鎳、銀和銅等重金屬的螯合物，同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，計(jì)算各競爭物的IC50值，比較重金屬鎘多克隆抗體對它們的親和性。

1.5 樣品添加回收試驗(yàn)

1.5.1 基質(zhì)影響消除 將河水樣品先使用0.22μm的濾膜進(jìn)行過濾，而自來水無需進(jìn)行過濾，然后用0.01mol／L的PBS將自來水、河水樣品分別稀釋2倍，5倍，10倍，分別和標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，若基質(zhì)曲線能與標(biāo)準(zhǔn)曲線重合，即基質(zhì)影響消除。

1.5.2 添加回收試驗(yàn) 向自來水、河水樣品中添加一定濃度的重金屬鎘，將海河水樣品先使用0.22μm的濾膜進(jìn)行過濾，而自來水無需過濾。然后用0.01mol／L的PBS稀釋一定倍數(shù)后，用間接競爭酶聯(lián)免疫法檢測樣品中重金屬鎘的含量并計(jì)算相應(yīng)的回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 間接競爭酶聯(lián)免疫法的建立

將制備 好 的500μg／mL的 Cd－EDTA 螯 合 物 使 用0.01mol／L的 PBS稀釋到1 000μg／L，然后從1 000μg／L開始5倍梯度稀釋成6個(gè)濃度，分別為0.32，1.6，8，40，200，1 000μg／L。根據(jù)式（1）計(jì)算Cd－EDTA各個(gè)濃度下的抑制率，然后繪制出重金屬鎘的標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 重金屬鎘間接競爭酶聯(lián)免疫法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of heavy metal cadmium using indirect competitive enzyme－linked immunosorbent assay

由圖1可知，建立的重金屬鎘間接競爭酶聯(lián)免疫法的檢測限（IC15，抑制率為15%時(shí)對應(yīng)的Cd－EDTA的濃度值）為0.76μg／L，靈敏度（IC50，抑制率為50%時(shí)對應(yīng)的 Cd－EDTA的濃度值）為11.33μg／L。

2.2 交叉反應(yīng)

為了判斷重金屬鎘多克隆抗體的特異性，本試驗(yàn)選取了9種金屬，分別是汞（Hg）、錳（Mn）、鉻（Cr）、鎂（Mg）、鐵（Fe）、鉛（Pb）、鎳（Ni）、銀（Ag）、銅（Cu）。它們與EDTA螯合后進(jìn)行交叉反應(yīng)，計(jì)算該抗體與金屬EDTA螯合物的交叉反應(yīng)率（CR%），見表1。

由表1可知，重金屬鎘多克隆抗體除了與重金屬汞的交叉反應(yīng)率為10.9%，與其他金屬錳（Mn）、鉻（Cr）、鎂（Mg）、鐵（Fe）、鉛（Pb）、鎳（Ni）、銀（Ag）、銅（Cu）的交叉反應(yīng)率均低于1.32%。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重金屬鎘多克隆抗體與金屬汞之間有一定的交叉反應(yīng)，其原因可能是由汞和鎘與螯合劑螯合后形成的空間構(gòu)型極為相似造成［8］。本試驗(yàn)得到的重金屬鎘抗體與其他金屬螯合物的交叉反應(yīng)率很低，這表明此抗體對于重金屬鎘螯合物有很強(qiáng)的特異性。

表1 抗體與金屬EDTA螯合物的交叉反應(yīng)Table 1 Cross－activities of the antibody with metal－chelates

2.3 水樣品的處理

將自來水樣品使用PBS分別稀釋2倍，5倍，10倍，而河水樣品使用濾膜過濾后也使用PBS進(jìn)行稀釋，與建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，由圖2和圖3可知，自來水和河水樣品使用0.01mol／L的PBS稀釋5倍后，樣品的基質(zhì)曲線和重金屬鎘標(biāo)準(zhǔn)曲線重合，即可消除基質(zhì)影響。本試驗(yàn)兩種水樣都是使用PBS稀釋5倍后基質(zhì)影響消除而非其他倍數(shù)，可能是水樣中離子強(qiáng)度也會影響基質(zhì)曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的重合。

圖2 自來水樣品的基質(zhì)影響消除Figure 2 Elimination of matrix effect in tap water samples

圖3 河水樣品的基質(zhì)影響曲線Figure 3 Elimination of matrix effect in river water samples

2.4 回收率

分別向自來水和河水樣品中添加一定濃度的重金屬鎘進(jìn)行回收率的測定，見表2。

表2 間接競爭酶聯(lián)免疫法重金屬鎘的回收率Table 2 Recovery of heavy metal cadmium using indirect competitive enzyme－linked immunosorbent assay

由表2可知，自來水和河水中鎘的平均回收率在93.95%～107.40%，變異系數(shù)在3.97%～14.69%。以上結(jié)果表明本試驗(yàn)建立的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測法有較高的準(zhǔn)確度和精確度，適用于水樣品中重金屬鎘的分析。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)成功制得了針對重金屬鎘的高特異性多克隆抗體，以此建立了水樣中重金屬鎘的間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法。水樣直接進(jìn)行稀釋即可用于檢測，有效提高了檢測效率。本方法可以用于水樣品中重金屬鎘的現(xiàn)場篩選和檢測。

1 Diane A Blake，R Mark Jones，Robert C Blake II.Antibodybased sensors for heavy metal ions［J］.Biosensors and Bioeletronics，2001，16（9）：799～809.

2 Mehraban Khosraviani，Andrey R Pavlov，George C.Flowers：detection of heavy metals by immunoassay：optimization and validation of a rapid，portable assay for ionic cadmium［J］.Environmental Science Technology，1998，32（1）：137～142.

3 唐勇，向軍儉，羅輝武，等.重金屬鎘離子單克隆抗體的制備［J］.食品科學(xué)，2005，26（9）：350～353.

4 王志坤，徐建偉，郭明.重金屬鎘離子檢測技術(shù)研究進(jìn)展［J］.食品工程，2008，2（6）：62～65.

5 Ibrahim A Darwish，Diane A Blake.One－step competitive immunoassay for cadmium ions：development and validation for environmental water samples［J］.Analytical Chemistry，2001，73（8）：1 889～1 895.

6 呂彩云.重金屬檢測方法研究綜述［J］.資陽開發(fā)與市場，2008，24（10）：887～898.

7 吳曉萍，廖愛琳，章超華，等.企鵝珍珠貝Cd－MT的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制［J］.食品與機(jī)械，2011，27（5）：107～110.

8 唐勇，王建華，向軍儉，等.鎘離子單克隆抗體的鑒定與競爭ELISA的建立［J］.免疫學(xué)雜志，2009，25（2）：214～217.

Development of heavy metal cadmium in water samples by indirect competitive enzyme－linked immunosorbent assay

WANG Jin SHENG Wei WANG Jun－ping FANG Shu－bing

YANG Yi－jin ZHANG Shu－guang WANG Shuo

（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Tianjin University of Science and technology，Tianjin300457，China）

An indirect competitive enzyme－linked immunosorbent assay was developed to low instrument cost detect cadmium in water samples using the polyclonal antibody.The limit of detection（IC15）was 0.76μg／L，and the sensitivity（IC50）was 11.33μg／L.The cross－reactivity rates of the antibody with other metals（Mn，Cr，Mg，F(xiàn)e，Pb，Ni，Ag and Cu）chelates were below 1.32%，except for Hg－chelate with a cross－reactivity rate 10.9%.The recoveries of cadmium in spiked tap water and river water were 93.95%～107.40%，and the coefficients of variation were 3.97%～14.69%.

cadmium；heavy metals immunological detection method；polyclonal antibody；ELISA；tap water；river water

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.023

王津（1987－），女，天津科技大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：choupiyuanyuan＠163.com

王碩

2011－12－01