苦蕎粉對小鼠腸道菌群的影響

申瑞玲張靜雯黨雪雅朱瑩瑩

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

苦蕎粉對小鼠腸道菌群的影響

申瑞玲1張靜雯2黨雪雅1朱瑩瑩1

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

為了探索苦蕎粉對小鼠腸道菌群的影響，給予小鼠不同劑量的苦蕎粉，35 d后考察其對小鼠結(jié)腸中大腸桿菌、乳酸桿菌以及雙歧桿菌的影響；并取小鼠空腸組織，研究苦蕎粉對小鼠腸道組織形態(tài)的影響。結(jié)果表明，與對照組相比，苦蕎粉的灌胃劑量大于3.250 g／（kg·d）時，小鼠腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量均顯著增加，同時大腸桿菌的數(shù)量顯著下降（P＜0.05）。灌胃苦蕎粉改變了小鼠空腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)。研究證實苦蕎粉可以作為益生元。

苦蕎粉；腸道菌群；乳酸桿菌；雙歧桿菌；大腸桿菌；益生元

苦蕎麥（buckwheat）屬于蓼科蕎麥屬谷類作物，學(xué)名韃靼蕎麥（f.tataricum），俗稱苦蕎，是一種藥食兩用植物，在中國資源極其豐富。研究［1］證實，苦蕎具有降血脂、降血糖，降低心血管疾病風(fēng)險的功效，但關(guān)于苦蕎對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用的研究則鮮有涉及。Hoy－Seon等的研究［2］顯示，苦蕎的甲醇提取物能促進無碳源培養(yǎng)基上乳酸桿菌的生長，并且抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌和大腸桿菌的生長，這項研究指出了苦蕎對腸道菌群有一定的作用，但苦蕎產(chǎn)品的攝入對腸道菌群的影響尚不清楚。Prestamo.G等［3］用苦蕎全粉飼喂老齡大鼠，結(jié)果表明，苦蕎全粉能夠促進大鼠腸道需氧菌和乳酸桿菌的數(shù)量的顯著增加（P≤0.05），而使大腸桿菌和致病菌的數(shù)量小幅度減少；研究還顯示，正常飼料和苦蕎全粉飼喂組大鼠腸道中都能檢出嗜酸乳桿菌、唾液乳酸桿菌、嬰兒雙歧桿菌，但植物乳桿菌、乳雙歧桿菌以及雙歧桿菌中的某些種只能在苦蕎飼喂組大鼠腸道內(nèi)容物中才能被檢出。這些結(jié)果都表明，苦蕎可以作為一種潛在益生元產(chǎn)品，但苦蕎對腸道菌群的影響還需要進一步研究和證實。因此，本試驗通過選用不同劑量的苦蕎粉，研究對小鼠腸道菌群和腸道組織形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

特制苦蕎全粉：山西金綠禾生物科技有限公司；

試驗小鼠基礎(chǔ)飼料：鄭州大學(xué)動物實驗中心。配方：大麥粉20%，脫水菜10%，豆粉20%，酵母1%，骨粉5%，玉米粉16%，魚粉10%，食鹽2%；

瓊脂、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、L－半胱氨酸鹽酸鹽等：均為分析純。

1.2 主要儀器

智能生化培養(yǎng)箱：LRH－150B型，廣東醫(yī)療器械廠；

超凈工作臺：SW－CJ－1FD型，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司；

電子天平：AL204／01型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

高壓蒸汽滅菌鍋：LS－B50L型，上海醫(yī)用核子儀器廠；

不少果蔬還是以鄉(xiāng)鎮(zhèn)一級的農(nóng)業(yè)合作社組織種植、管理、銷售的，以下以柿餅全過程追溯為例展開研究，柿餅追溯系統(tǒng)的需要對柿餅供應(yīng)鏈的每個流程進行管理，主要包括原料采購、生產(chǎn)加工統(tǒng)一標(biāo)識、營銷活動、物流過程等幾個主要方面。

顯微鏡：XSP－BM－12CA型，上海彼愛姆光學(xué)儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗動物及分組 試驗動物適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后隨機分為4組，每組10只，分別為對照組，低、中和高3個不同劑量苦蕎全粉組，各組喂以基礎(chǔ)飼料的基礎(chǔ)上，對照組小鼠灌胃

1 m L生理鹽水，3個試驗組每日灌胃給予不同劑量的苦蕎全粉液1 m L，各組小鼠均自由取食和飲水，灌胃期35 d。

表1 苦蕎粉灌胃劑量Table 1 The dosage of buckwheat administrated by gastric perfusion ／（g·kg－1·d－1）

1.3.2 腸道菌群培養(yǎng)

（1）大腸桿菌：麥康凱培養(yǎng)基，37℃有氧培養(yǎng)24 h后進行菌落記數(shù)；

（2）乳酸桿菌：SL培養(yǎng)基；

（3）雙歧桿菌：PTYG培養(yǎng)基。

乳酸桿菌和雙歧桿菌均在37℃，厭氧培養(yǎng)72 h進行菌落記數(shù)。厭氧培養(yǎng)方法：采用在干燥器中將燭缸法與焦性沒食子酸法相結(jié)合的厭氧方法。利用蠟燭燃燒耗盡干燥器內(nèi)的氧氣和焦性沒食子酸在堿性溶液內(nèi)能大量吸氧的原理進行厭氧培養(yǎng)。每100 cm3空間用焦性沒食子酸1.0 g，10%NaOH 10 m L。

1.3.3 腸道菌群分析 灌胃期結(jié)束后，將各組小鼠斷頸處死后立即無菌操作取0.1～0.2 g結(jié)腸內(nèi)容物，將其分別稀釋到10－1～10－6，選擇合適的稀釋度樣品50μL分別接種于選擇性培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，每個稀釋度做3個平行板。在菌落記數(shù)前先挑取特征性菌落，進行形態(tài)和生化試驗鑒定菌屬，之后統(tǒng)計大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌菌落數(shù)目，并計算得到雙歧桿菌與大腸桿菌數(shù)量之比B／E。按式（1）計算出每克結(jié)腸內(nèi)容物中的菌落總數(shù)（CFU），試驗結(jié)果以每克腸道內(nèi)容物中的細菌菌落數(shù)的對數(shù)值lg CFU表示。

式中：

CFU——每克結(jié)腸內(nèi)容物中的菌落總數(shù)，CFU；

A——合適稀釋度下，平板上的細菌菌落數(shù)，CFU；

10n——相應(yīng)菌落數(shù)相所對應(yīng)的稀釋度；

20——相應(yīng)的換算系數(shù)。

1.3.4 腸道組織形態(tài)學(xué)檢查 灌胃期結(jié)束后，迅速取各組小鼠空腸中段各2～3 mm，用生理鹽沖洗腸道內(nèi)容物。以福爾馬林溶液固定，24 h后，用70%酒精固定，常規(guī)石蠟包埋后切片，HE染色，中性樹脂封片，在40倍物鏡下觀察腸壁組織形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計方法

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS統(tǒng)計軟件進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎全粉營養(yǎng)組成分析

表2為本試驗所用苦蕎全粉的營養(yǎng)組成。由表2可知，苦蕎全粉含有較高含量的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、總糖以及粗纖維，除此以外，測得苦蕎全粉的抗性淀粉含量高達6.95%?？剐缘矸墼谛∧c內(nèi)不被消化吸收，而在大腸內(nèi)可被微生物發(fā)酵利用，具有類似膳食纖維的作用；膳食纖維能促進腸道蠕動，提高腸道機能，改善排便狀況［4］。由此推論，苦蕎全粉中的膳食纖維和難消化的碳水化合物，尤其是抗性淀粉成分可能影響腸道的菌群組成。

表2 苦蕎全粉營養(yǎng)成分Table 2 The basic nutritional components in buckwheat flour ／%

2.2 苦蕎全粉對各組小鼠腸道菌群的影響

不同劑量的苦蕎全粉對小鼠腸道菌群影響結(jié)果見表3。由表3可知，與對照組小鼠腸道大腸桿菌數(shù)量相比，低劑量組差異不顯著（P＞0.05）；而中劑量組和高劑量組差異顯著（P＜0.05）；低劑量組和高劑量組之間差異顯著（P＜0.05）。說明隨著苦蕎全粉攝入劑量的增加，小鼠結(jié)腸大腸桿菌的受抑制程度也隨之變得明顯。

表3 苦蕎全粉對小鼠腸道菌群的影響+Table 3 Effect of buckwheat flour on intestinal flora in mice ／lg CFU

與對照組相比，各試驗組小鼠結(jié)腸內(nèi)容物中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量都有顯著差異（P＜0.05）。其中，低劑量組和中劑量組間乳酸桿菌差異不顯著（P＞0.05），而高劑量組與其它組間則存在顯著差異（P＜0.05）。3個劑量之間雙歧桿菌的增值都存在顯著差異性（P＜0.05）。說明苦蕎全粉能夠促進小鼠結(jié)腸中益生菌的增值，增值效果隨劑量有很大差異性。并且，隨著苦蕎全粉攝入劑量的增加，B／E值也隨之而增加，說明對雙歧桿菌的增值程度非常顯著。

腸道微生物對維持腸道正常的生理具有重要作用，而腸道微生物生長繁殖所需發(fā)酵底物主要來自進入大腸的多糖、低聚糖、蛋白質(zhì)、肽和糖蛋白等未消化殘渣［5］，有研究［6］表明，抗性淀粉可以促進益生菌的增值?？嗍w全粉中所含的蛋白質(zhì)、抗性淀粉等膳食纖維組分被小鼠結(jié)腸內(nèi)的微生物發(fā)酵利用，從而改善了腸道菌群的結(jié)構(gòu)。另一方面，抗性淀粉等組分能夠被腸道細菌發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸［7］，雙歧桿菌和乳酸桿菌在自身的代謝中也會產(chǎn)生乳酸，這些酸性物質(zhì)可以降低腸道p H值，腸道的酸性環(huán)境具有較強的抑菌和殺菌作用，能夠控制病原菌的生長和繁殖［8］。

2.3 苦蕎全粉對小鼠空腸組織形態(tài)的影響

灌胃不同劑量的苦蕎全粉35 d后，小鼠腸道組織形態(tài)也受到了一定影響［8］，結(jié)果見圖1。

圖1 苦蕎全粉對小鼠空腸組織形態(tài)的影響（×40）Figure 1 The effect of buckwheat flour on the morphology of jejunum in mice（×40）

由圖1可知，對照組小鼠空腸絨毛排列整齊緊密，腸粘膜完整（圖1（a））。與對照組相比，低劑量組（圖1（b））腸絨毛有縮短趨勢，排列較為紊亂疏松，且腸壁變?。恢袆┝拷M（圖1（c））不僅腸絨毛變短、有輕微斷裂，腸壁變薄，而且絨毛下腺體明顯增多；而高劑量組（圖1（d））腸絨毛大部分斷裂，腸壁最薄。腸道絨毛萎縮，腸壁厚度變薄會造成營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的面積減小［9］。這說明苦蕎全粉較難消化吸收，因此其中的部分物質(zhì)才能在大腸中停留較長時間，這有助于作為腸道微生物發(fā)酵的底物。其詳細的物質(zhì)基礎(chǔ)和機理還有待于進一步深入。

3 結(jié)論

試驗表明，當(dāng)苦蕎全粉的灌胃劑量大于3.250 g／（kg·d）時，小鼠腸道中的有益菌數(shù)量顯著增加，而大腸桿菌的數(shù)量顯著下降，說明苦蕎全粉具有改善腸道菌群結(jié)構(gòu)的功能。另外苦蕎全粉的攝入，具有影響腸道組織形態(tài)的作用，干擾營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力。本試驗直接考察了苦蕎全粉對小鼠腸道菌群的影響，沒有確定苦蕎中發(fā)揮益生作用的主要成分，并且缺少對苦蕎粉在結(jié)腸發(fā)酵的深層次的研究。這一部分的內(nèi)容將會是本課題組下一階段的研究重點。

1 趙鋼，唐字，王安虎.苦蕎的成分功能研究與開發(fā)應(yīng)用［J］.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，19（4）：355～358.

2 Hoy Seon L，Moo Key K.Growth responses of grain extracts on human intestinal bacteria［J］.Food Science and Biotechnology，2000，9：387～390.

3 Prestamo G，Pedrazuela A，Penas E，et al.Role of buckwheat diet on rats as prebiotic and healthy food［J］.Nutrition Research，2003，23：803～814.

4 朱瑞，高南南，陳建民.苦蕎麥的化學(xué)成分和藥理作用［J］.中國野生植物資源，2003（5）：19～20.

5 Taro K，Hirotaka N，Hiroshi O，et al.The hypocholesterolemic effect of high amylose corn starch in rats is mediated by an en1arged bi1e acid pool and increased fecal bi1e acid excretion，not by cecal fermented products［J］.J.Nutr.，2002，132：2 519～2 524.

6 龐秋芳，彭喜春，歐仕益，等.直腸菌群對兩種抗性淀粉的體外發(fā)酵研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（4）：148～151.

7 劉雄，張煥容，楊發(fā)龍.高直鏈玉米淀粉對大鼠腸道發(fā)酵影響的研究［J］.營養(yǎng)學(xué)報，2007，29（4）：372～375.

8 韓正康.家畜營養(yǎng)生理學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

9 申瑞玲，王章存，姚惠源.燕麥β－葡聚糖對小鼠腸道菌群的影響［J］.食品科學(xué)，2005，26（2）：208～212.

Effect of buckwheat flour on intestinal flora in mice

SHEN Rui－ling1ZHANG Jing－wen2DANG Xue－ya1ZHU Ying－ying1

（1.School of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，Henan450002，China；2.Henan Vocational and Technical College，Zhengzhou，Henan450046，China）

To explore the effect of the different doses of buckwheat flour on intestinal flora in mice.Mice were randomly assigned to get different doses of buckwheat flour by intragastric administration.The microbial analysis on the intestinal flora in colon of mice was carried out 35 days later and the tissue morphology of the jejunum was observed.The results showed that the number ofEscherichia colidecreased while the number ofLactobacillusandBifidobacteriumincreased in experimental groups at dose of 3.250 g／（kg·d）compared with the control in mice colon（P＜0.05）.The jejunum tissues of mice were also changed.The research confirmed buckwheat flour could act as a kind of prebiotics.

buckwheat flour； intestinal flora；lactobacillus；bifidobacterium；escherichia coli；prebiotics

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.009

河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃項目（編號：2011HASTLT021）

申瑞玲（1967－），女，鄭州輕工業(yè)學(xué)院教授，博士。

E－mail：shenruiling2002＠yahoo.com.cn

2011－08－01