大棗多糖的提取工藝及抗氧化作用研究

亓樹艷 王 荔 莫曉燕

（西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710049）

大棗多糖的提取工藝及抗氧化作用研究

亓樹艷 王 荔 莫曉燕

（西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710049）

通過設(shè)計正交試驗優(yōu)化水浸、超聲和微波等方法提取大棗多糖的工藝，在優(yōu)化條件下，3種方法大棗多糖提取率分別達到11.33%、12.40%、10.98%。體外抗氧化研究結(jié)果表明，0.075～0.135mg/mL大棗多糖對·OH 自由基最大清除率分別為48.5%（微波法），47.1%（水浸法），28.2%（超聲法）。3種方法獲得的大棗多糖提取液均具有體外清除·OH的作用，并呈明顯的量效關(guān)系，但不同提取方法獲得的大棗多糖在抗氧化方面表現(xiàn)出較大的差異，說明提取工藝與其生物學(xué)效能密切相關(guān)。綜合提取工藝、多糖提取率以及抗氧化作用效率，微波法提取大棗多糖效果最佳。

大棗；多糖；提取工藝；抗氧化

大棗是鼠李科棗屬植物棗樹的果實，其中含有比一般水果高1倍多的糖分，據(jù)分析［1］，100g鮮棗含有碳水化合物23.2g，而100g干棗含有碳水化合物50.3～86.9g。大棗中總糖以還原糖為主，主要為葡萄糖和果糖，還含有蔗糖和由葡萄糖與果糖組成的低聚糖、阿拉伯聚糖及半乳糖醛酸聚糖等［2］。研究［3］發(fā)現(xiàn)，大棗多糖是由葡萄糖、D－（＋）－木糖和D－（＋）半乳糖組成。它具有提高機體免疫力、抗腫瘤、抗衰老等多種生物學(xué)功能，能有效清除人體內(nèi)的氧自由基，明顯減輕衰老模型小鼠免疫器官的萎縮及腦組織老化，是抗衰老的主要活性成分［4，5］。本試驗采用水浸、超聲和微波3種方法提取大棗多糖，并對提取工藝進行優(yōu)化，同時進一步考察不同方法得到的大棗多糖體外抗氧化作用，以期為大棗多糖的工業(yè)化生產(chǎn)及其綜合利用提供更多思路。

1 材料與方法

1.1 材料

大棗：產(chǎn)地為山東，購于西安農(nóng)貿(mào)市場，－20℃儲藏。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

脂肪提取器：1792，上海華美實驗儀器廠；

數(shù)控型超聲波清洗器：KQ－100DE，昆山市超聲儀器有限公司；

機械微波爐：PJ21F－B，美的股份有限公司；

紫外－可見分光光度計：DU－640，美國Beckman公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52A，上海亞榮生化儀器廠；

高速冷凍離心機：J2－MC，美國Beckman公司。

1.2.2 試劑

蒽酮、濃硫酸、葡萄糖、無水乙醇、丙酮、三氯甲烷、正丁醇、30%雙氧水、硫酸亞鐵等：均為國產(chǎn)分析純；

粉末活性炭：國產(chǎn)化學(xué)試劑。

1.3 多糖含量測定

1.3.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 稱取于80℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100g，加水定容至100mL，得到1mg/mL母液，再逐步稀釋成濃度為0，0.028，0.048，0.068，0.08mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；分別取1.0mL置于10mL具塞試管中，冰浴5min，加入當(dāng)日新配制的0.2%蒽酮－硫酸溶液（0.2g蒽酮溶于100mL濃硫酸），沸水浴3min；取出用冷水冷卻至室溫，靜置10min；于620nm以吸光度對葡萄糖濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［6］。

1.3.2 樣品測定 取1.0mL大棗多糖提取液按照上述方法測定620nm吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算多糖含量。

1.4 大棗多糖提取工藝

1.4.1 工藝流程

大棗烘干→粉碎→稱重→脫脂回流→浸提（水浸法、超聲法、微波法）→上清液→乙醇沉淀→復(fù)溶→去除蛋白質(zhì)→脫色→粗多糖［7，8］

1.4.2 原料預(yù)處理 將市售大棗手工剝皮去核，放入80℃烘箱中烘至水分＜5%，再放入研缽中研成粉末過20目篩，置于干燥器中備用。

1.4.3 脫脂 將棗粉用濾紙包好，放入脂肪提取器浸提管底部；于已稱重的小燒瓶中加入150mL無水乙醇；連接脂肪提取器的其他部分，恒溫加熱回流2h，每小時回流3次。

1.4.4 乙醇沉淀 在大棗提取液中加入4倍體積無水乙醇，使最終乙醇濃度為80%，沉淀多糖［9］。

1.4.5 去除蛋白質(zhì) Sevage法脫蛋白，三氯甲烷與正丁醇的比例為4∶1，以相同的體積與被分離液體混合。

1.4.6 活性炭脫色 按照大棗干粉重的5%加入活性炭脫色。

1.4.7 粗多糖含量測定 脫色后的樣品經(jīng)真空冷凍干燥后制得粗多糖，測定多糖含量，按式（1）計算提取率。

式中：

R——大棗多糖提取率，%；

C—— 多糖濃度，g/mL；

V—— 多糖溶液體積，mL；

M—— 干棗粉質(zhì)量，g。

1.5 提取工藝優(yōu)化

1.5.1 水浸法提取工藝優(yōu)化 每組原料為1.5g，采用1.4中的多糖提取工藝，根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果選擇溫度、時間料液比和pH值4個因素按表1進行正交試驗。

1.5.2 超聲法輔助提取工藝優(yōu)化 每組原料為1.5g，料液比為1∶20（m∶V），采用1.4中的多糖提取工藝，根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果選擇溫度、時間、pH值和功率4個因素按表2進行正交試驗。

在光源的選擇上，首先需要考慮激光的波長對系統(tǒng)的影響.如圖7所示，分別以常用的中心波長為325 nm、488 nm和632 nm的單色激光作為光源，在matlab中畫出歸一化光強隨腔長變化的曲線.根據(jù)式(2)可得，光強的極大值和極小值分別為

表1 水浸法因素水平表Table 1 Factor and level of water soak method

表2 超聲法因素水平表Table 2 Factor and level of ultrasonic method

1.5.3 微波法提取工藝優(yōu)化 每組原料為1.5g，料液比為1∶20（m∶V），采用1.4中的多糖提取工藝，將脫脂回流得到的大棗粉用水浸泡，調(diào)節(jié)pH后進行微波提取，微波功率用中火。根據(jù)前期單因素試驗結(jié)果選擇浸泡時間、pH值和微波時間3個因素按表3進行正交試驗。

表3 微波法因素水平表Table 3 Factor and level of microwave method

1.6 大棗多糖體外抗氧化研究

取7支試管，各加入濃度為0.75mmol/L的FeSO4 1mL混勻，向其中5支試管中分別加入0.3mg/mL多糖溶液1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mL，再加入0.1%H2O21.0mL；另2支試管分別作為損傷管（不加多糖提取液）和未損傷管（不加H2O2），用蒸餾水將各管反應(yīng)體積補至4mL，37℃保溫1h，分別測定各管536nm處的吸光值，重復(fù)兩次，取平均值按式（2）計算大棗多糖的·OH清除率［10］。

式中：

R1——·OH清除率，%；

A2——多糖樣品管在536nm下的吸光值；

A1——未損傷管在536nm下的吸光值；

A0——損傷管在536nm下的吸光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 大棗多糖提取工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 水浸法提取工藝優(yōu)化 浸提溫度、浸提時間、料液比和pH 4個因素正交試驗結(jié)果及極差分析見表4。由表4可知，對大棗多糖提取率的影響因素大小依次為pH＞浸提溫度＞料液比＞浸提時間；水浸法提取大棗多糖的最佳條件是A1B3C3D3，在料液比1∶30（m∶V）、pH 8、90℃水浸3h條件下，大棗多糖提取率可達11.33%。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of glucose

表4 水浸法正交試驗結(jié)果Table 4 Orthogonal experiment result of water soak method

2.2.2 超聲法提取工藝優(yōu)化 超聲溫度、超聲時間、pH和超聲功率4個因素正交試驗結(jié)果及極差分析見表5。由表5可知，對大棗多糖提取率的影響因素大小順序為pH＞超聲時間＞超聲溫度＞超聲功率；超聲法提取大棗多糖的最佳提取條件為E1F1G3H2，經(jīng)驗證實驗，在pH 8、功率60W、60℃超聲10min條件下，大棗多糖提取率為12.40%。

表5 超聲法正交試驗結(jié)果Table 5 Orthogonal experiment result of ultrasonic method

2.2.3 微波法提取工藝優(yōu)化 浸泡時間、pH和微波時間3個因素正交試驗結(jié)果及極差分析見表6。

表6 微波法正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal experiment result of microwave method

由表6可知，對大棗多糖提取率的影響因素大小依次為浸泡時間＞微波時間＞pH；微波法提取大棗多糖的最佳條件是I3J3K2，即大棗干粉在pH 8時浸泡80min后微波提取4min，經(jīng)驗證實驗，該條件下大棗多糖的提取率為10.98%。

2.3 大棗多糖的抗氧化研究結(jié)果

羥基自由基（·OH）是目前所知活性氧中活性最強的一種自由基，它幾乎可與細胞內(nèi)的一切有機化合物反應(yīng)，并引起系列連鎖反應(yīng)，從而破壞核酸、蛋白質(zhì)、脂類化合物，進而損傷細胞的結(jié)構(gòu)與功能；它還可以直接損傷各種生物膜，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，從而危及生物體，·OH 清除率是抗氧化作用的重要指標(biāo)［11，12］。在0.075～0.135mg/mL大棗多糖濃度的范圍內(nèi)，分別對3種不同方法得到的大棗多糖提取液進行清除·OH對比研究。由圖2可知，3種方法提取的大棗多糖樣品液均具有體外清除·OH的作用，并且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。但不同提取方法獲得的大棗多糖對·OH自由基的清除率有較大的差異，最大清除率分別為48.5%（微波法），47.1%（水浸法），28.2%（超聲法），微波法提取液和水浸法提取液清除·OH的效果分別為超聲法提取液的1.72倍和1.67倍。

圖2 不同大棗多糖提取液體外清除·OH的作用Figure 2 The scavenging·OH effects in vitro of different jujube polysaccharide extracts

大棗多糖抗氧化機理與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，多糖分子具有還原性的半縮醛羥基，能與氧化劑－活性氧發(fā)生氧化還原反應(yīng)。李玲等［13］研究表明大棗多糖對活性氧具有清除作用，且清除效果與多糖用量呈正相關(guān)。超聲和微波法分別通過空化效應(yīng)和高能作用破壞細胞壁，影響細胞壁的通透性，加快對胞內(nèi)多糖的提取率［13］，同時，也會造成多糖成分中側(cè)鏈和糖苷鍵結(jié)構(gòu)不同程度的降解斷裂，改變多糖分子結(jié)構(gòu)，進而影響它的生物活性。推測其原因可能是不同的提取工藝除了影響活性多糖的提取率外，還會影響多糖的組成、立體結(jié)構(gòu)，進而影響多糖的生物活性［14］；也可能是由于大棗多糖提取液中還存在其它一些抗氧化作用物質(zhì)（如酚類、黃酮類、色素等）的協(xié)同作用有所不同造成的［15－17］。

3 結(jié)論

本試驗在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過設(shè)計正交試驗優(yōu)化了水浸、超聲和微波3種方法提取大棗多糖的工藝條件。從大棗多糖提取率看，3種方法均可有效提取大棗多糖，但相對水浸法，超聲法和微波法具有省時、高效等特點。此外，通過體外清除羥自由基的檢測進一步證實大棗多糖是天然的抗氧化劑，但是3種方法獲得的大棗多糖提取液對·OH的清除效果有所不同，提示提取工藝與其生物學(xué)效能密切相關(guān)。今后有必要對不同方法提取的大棗多糖的分子組成、立體結(jié)構(gòu)以及大棗多糖提取液中含有的其他抗氧化物質(zhì)進行深入研究。

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Research on extraction condition and anti－oxidation of jujube polysaccharide

QI Shu－yan WANG LiMO Xiao－yan

（School of Life Science and Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi’an，Shaanxi710049，China）

The extraction conditions of jujube polysaccharide were optimized by designing orthogonal experiment，and the extraction rates of jujube polysaccharide were 11.33%with water soak method，12.40%with ultrasonic method and 10.98%with microwave method under the optimal conditions.The study on anti－oxidation confirmed that in the concentration range of 0.075mg/mL to 0.135mg/mL the maximum scavenging ratio was 48.5%（microwave），47.1%（water soak）and 28.2% （ultrasonic）respectively.Three kinds of jujube polysaccharide extracts could scavenge·OH in vitro，which showed the relationship to dose－dependence，but the anti－oxidation of jujube polysaccharide extracted with the different extraction method has the significant deviation.It shows that the bioactivities of jujube polysaccharide depend on the extraction condition.In view of these results，the microwave method has the best effect in the extraction of jujube polysaccharide by synthesizing extraction process，extraction rates and anti－oxidation efficiency.

jujube；polysaccharide；extraction condition；anti－oxidation

10.3969 /j.issn.1003－5788.2012.04.032

亓樹艷（1984－），女，西安交通大學(xué)助理工程師。E－mail：qishuyan＠m(xù)ail.xjtu.edu.cn

莫曉燕

2012－04－10