利用dsDNA層層膜檢測芬頓試劑對天然DNA的損傷

(甘肅工業(yè)職業(yè)技術學院化工學院，甘肅天水74025)

利用dsDNA層層膜檢測芬頓試劑對天然DNA的損傷

廖天錄，劉軍

(甘肅工業(yè)職業(yè)技術學院化工學院，甘肅天水74025)

憑借聚陽離子聚乙烯亞胺(PEI)和帶負電荷的DNA存在的相互之間的靜電作用交替吸附在玻碳電極表面，進而形成非常有序的{dsDNA/PEI}2層層膜.采用槲皮素作為電活性指示劑來檢測芬頓試劑對天然dsDNA的損傷.由于槲皮素在DNA多層膜中具有的非常特別的可逆吸入模式，這中模式能夠明顯分辨損傷和未損傷DNA多層膜的吸入量.由此檢測芬頓反應引起的DNA的氧化性損傷，可以提供一種新的檢測DNA損傷的電化學方法.

dsDNA層層膜;芬頓試劑;槲皮素;DNA損傷

DNA是生物遺傳信息的基本載體.一般它的分子結構不會在活動過程中改變，然而，生物體內(nèi)外部的一些物理和化學因素很有可能使得它的分子結構發(fā)生異常變化，這就稱為是DNA的損傷［1］.所以，研究DNA損傷的檢測具有重大意義，它對于新化合物的毒性篩選、生物污染物的檢控以及生態(tài)毒性學研究具有現(xiàn)實意義.電化學方法是檢測DNA損傷的一種新的可選擇的檢測手段［2－3］，它具有簡單、快速、靈敏、價格低等諸多優(yōu)點.過氧化氫與催化劑Fe2+構成的氧化體系通常稱為芬頓試劑.芬頓反應產(chǎn)生羥基自由基對DNA的損傷已得到證實［4］.本文中，采用槲皮素作為電活性指示劑與dsDNA的嵌入作用來檢測芬頓試劑對天然DNA的損傷.

1 實驗部分

1.1 試劑

聚乙烯亞胺(PEI，MW－1800)購于Alfa Aesar公司;小牛胸腺DNA(北京華美生物工程公司);雙氧水(H2O2，質量分數(shù)30%)購于天津市化學試劑公司;硫酸亞鐵(FeSO4)購于與成都臨江化工廠;槲皮素購于中國科學院蘭州化物所;其它所用試劑均是分析純，水是于4℃條件下儲存的二次蒸餾水.在每次試驗前均需用高純度氮氣除去氧氣.除了DNA損傷的實驗外所有實驗都是在室溫(20±2)℃下進行的.本實驗所用的0.1mol/L醋酸鹽緩沖溶液(pH=5.0)均需進行CV測試.

1.2 儀器

CHI832電化學工作站(美國)上完成，Branson200超聲清洗儀(美國);pHS－3C型酸度計(上海);石英管加熱式自動雙重純水蒸餾器(1810B，上海亞太技術玻璃公司)，玻碳電極的直徑是3.5mm.

1.3 實驗過程

(1)先用0.1μm和0.05μm的拋光粉對玻碳電極分別進行拋光，之后將拋光好的玻碳電極放到超聲清洗器里使用準備好的丙酮和二次水分別進行5分鐘的清洗，接下來再用氮氣將其吹干.之后再將該電極交替分別浸入到聚乙烯亞胺和dsDNA中各10分鐘，直至他們能夠交替吸附到電極表面，這中間還需用二次水沖洗，此時會形成一層膜它就是{dsDNA/PEI}膜.然后依據(jù)設計好的膜層數(shù)再對上述實驗過程操作2次，最后可以獲得多層膜{dsDNA/PEI}2.

(2)室溫下在5mL電解池中進行循環(huán)伏安實驗.工作電極為裸玻碳電極、DNA修飾電極或DNA與槲皮素產(chǎn)物的修飾電極.鉑電極為對電極，Ag/AgCl(飽和KCl)為參比電極.

(3)槲皮素吸入上面的多層膜是通過將該膜電極浸泡在1×10－4mol/L槲皮素緩沖溶液(pH=5.0，含0.1M NaCl)里，不斷攪拌至少2小時直到達到吸入平衡或穩(wěn)定狀態(tài).此時吸入槲皮素量最多狀態(tài)的膜就被指定為{dsDNA/PEI}2－QC膜，然后利用醋酸緩沖液對該膜進行清洗并用氮氣吹干，之后將它放入到醋酸緩沖液中進行CV掃描.在此狀態(tài)的DPV氧化峰電流就被定為I0.之后把該狀態(tài)的該膜在醋酸緩沖液中進行浸泡一夜，使QC從膜中最大限度的釋放出來，而且還需不間斷的把該膜放入醋酸緩沖溶液中進行CV掃描.而針對DNA損傷實驗，我們需要把充分吸附了槲皮素的該膜放入到緩沖液中1小時使盡可能多的在膜中非特殊鍵合槲皮素釋放出來［5］.然后將該膜放入到含硫酸亞鐵(1.5mmol/L)和雙氧水(0.5mol/L)的醋酸鹽緩沖溶液中［6］，并在37℃下攪拌一段時間對DNA的損傷.為了除去DNA膜上吸附的芬頓試劑與非特殊鍵合槲皮素，再把損傷的該膜放入到緩沖溶液中浸泡1小時.之后將損傷的該膜放入醋酸緩沖液中CV掃描，此時CV氧化峰電流指定為It.而且每次檢測對上述過程至少重復3次，DNA損傷實驗都在暗室中進行.

2 結果和討論

把充分吸附了槲皮素的{dsDNA/PEI}2－QC膜先浸泡到緩沖液里1小時為使更多的在膜中非特殊鍵合槲皮素能夠釋放出來［6］.然后使該膜在芬頓試劑中37℃下溫浴并攪拌一定時間對DNA損傷.為了除去吸附于膜上的芬頓試劑和非特殊鍵合槲皮素.還需再將DNA受損傷的膜浸泡于緩沖液中1小時，浸泡之后立即將吸入大量槲皮素的膜電極放入到醋酸緩沖液中進行CV測試.圖1是該膜在芬頓試劑中溫浴不同時間的循環(huán)伏安圖.從該圖不難看出，隨著溫浴時間的不斷增加，氧化還原峰電流反而不斷減小.此現(xiàn)象說明受損傷的dsDNA多層膜能夠吸入的槲皮素根本不能達到未損傷的dsDNA多層膜吸入的槲皮素的相同水平，對dsDNA在{dsDNA/PEI}2中的損傷檢測是通過循環(huán)伏安實驗進行.實驗中，每個膜電極只能循環(huán)使用一次.為了保證膜電極變化的真實性，必須使用新制成的膜電極重復實驗.

通過氧化峰電流的比率與膜在芬頓試劑中溫浴時間的斜率可以測定dsDNA在該膜中的損傷率(圖2)，其中，I0和It分別是該膜在芬頓試劑溶液中沒有溫浴和溫浴時間t(t在10分鐘之內(nèi))的氧化峰電流.用相對峰電流的比率代替絕對峰電流是為了有效的測定DNA的損傷.相對峰電流的比率隨著在芬頓試劑溶液中溫浴時間線性增加，損失率為0.3843min－1，相關系數(shù)為0.9981，證明了我們建立在以槲皮素作為電活性指示劑與dsDNA層層膜相結合的基因毒性傳感器可以有效的檢測DNA損傷.

在含亞鐵離子的酸性液中添加一定量的過氧化氫時，H2O2能夠生成一種氫氧自由基(Fe2+作為催化劑)，又因為羥基自由基可以產(chǎn)生對DNA的氧化損傷，進而導致DNA的鏈產(chǎn)生斷裂，從而生成8－氧鳥嘌呤(8－oxo－G)和一些其它的加合物［7－8］.芬頓反應誘導氧化DNA將擾亂或完全破壞一些在DNA雙螺旋鄰近堿基對形成的π－π堆積.在我們的實驗中，由于槲皮素分子能夠嵌入到DNA雙螺旋鄰近堿基對當中，因此才有大量的槲皮素分子吸入到{dsDNA/PEI}2膜，尤其是浸入到緩沖溶液中1小時之后，損傷的DNA就能夠從受到破壞的雙螺旋結構中把大量的槲皮素分子釋放出，此時的CV響應會減小，這也說明在最初10分鐘之內(nèi)相對峰電流的比率隨著在芬頓試劑中溫浴時間的增加而線性增加，這是因為羥基自由基不穩(wěn)定，而且存在的時間也較短，然而在溫浴10分鐘以后，反而CV的峰電流不再會隨著溫浴時間的增加而減少.這其中的原因是在溫浴最初的10分鐘之內(nèi)膜中易受損傷的DNA的活性點已經(jīng)完全消耗殆盡.

圖1 充分吸附了槲皮素的{dsDNA/PEI}2－QC膜在芬頓試劑溶液中溫浴不同時間的循環(huán)伏安

圖2 氧化峰電流的比率與{dsDNA/PEI}2－QC膜在芬頓試劑溶液中溫浴時間的斜率

3 結束語

本文采用槲皮素作為電活性指示劑吸入{dsDNA/PEI}2膜，進而憑借芬頓試劑對天然DNA損傷進行檢測，由于槲皮素所擁有的DNA多層膜中的非常特別的可逆吸入方式，憑借它我們可以很好分辨出槲皮素在損傷和未損傷DNA多層膜中的吸入量，并將槲皮素從膜中的漏泄量減少到最小.槲皮素能夠嵌入到雙鏈DNA與其結合.因此{dsDNA/PEI}2－QC能夠成功檢測出芬頓試劑對天然DNA的損傷.該膜系統(tǒng)將為我們今后找到更多合適體系檢測DNA的損傷提供了引導.作為DNA損傷傳感器可以為化學損傷DNA提供一個普遍的、靈敏的檢測方法.

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Q523

A

1008－7974(2012)08－0021－02

2011年甘肅省天水市市級財政專項資金項目;甘肅工業(yè)職業(yè)技術學院基金項目(Gzy2011－17).

2011－10－23

廖天錄(1974－)，甘肅天水人，碩士，甘肅工業(yè)職業(yè)技術學院化工學院講師.

(責任編輯:水行)