萘對海洋三角褐指藻生長的毒性效應(yīng)及生化指標(biāo)研究

李艷梅,曾文爐,余 強(qiáng),周啟星 (南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室,天津 300071)

萘對海洋三角褐指藻生長的毒性效應(yīng)及生化指標(biāo)研究

李艷梅,曾文爐,余 強(qiáng),周啟星*(南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點實驗室,天津市城市生態(tài)環(huán)境修復(fù)與污染防治重點實驗室,天津 300071)

選擇在海洋中分布廣泛的浮游植物海洋硅藻門的三角褐指藻(Phaeodactylum tricomutum) 作為目標(biāo)生物,研究了不同萘濃度水平對海洋微藻的生態(tài)毒性效應(yīng),并同步監(jiān)測了萘的真實濃度.結(jié)果表明,在0~168h內(nèi),與對照相比,低濃度萘(初始濃度為0.048~2mg/L)處理組藻的吸光度以及葉黃素、胡蘿卜素含量無明顯差異.但當(dāng)萘處理初始濃度達(dá)到8mg/L甚至更大時,吸光度、葉黃素和胡蘿卜素含量隨萘濃度增加而迅速下降,呈現(xiàn)一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系.隨萘濃度的升高,各處理組中藻類體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性呈現(xiàn)先升高后下降的“鐘形曲線”趨勢,而藻類脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量則呈現(xiàn)先略降低而后急劇上升的趨勢.

水體污染；海洋三角褐指藻；萘；毒性效應(yīng)

近年來,世界范圍內(nèi)的海上溢油事故頻發(fā),給海洋生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重的破壞.萘是石油多環(huán)芳烴最主要的成分之一[1].在原油中,相對于其他高分子量的多環(huán)芳烴(含 3~6個環(huán)),萘的濃度更高.因此,萘成為溢油對海洋生態(tài)風(fēng)險評估的特征污染物之一[2].

作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中的最主要初級生產(chǎn)者,海洋微藻是許多海洋生物活性物質(zhì)的最初來源,是海洋生物資源的重要組成部分.它們的盛衰直接或間接地影響著整個海洋生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力[3].研究表明[4],海洋微藻對溢油的生態(tài)毒害反應(yīng)靈敏,且呈現(xiàn)種類差異性.低濃度溢油的長期作用,將導(dǎo)致包括微藻在內(nèi)的浮游生物種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[5].

海洋硅藻是近海海洋浮游植物的主要類群,其數(shù)量和種類均可占 90%以上,是近海初級生產(chǎn)力的主要貢獻(xiàn)者[6].海洋三角褐指藻屬硅藻門,對鹽度和溫度都具有極強(qiáng)的適應(yīng)性,易于培養(yǎng).因此,選取海洋三角褐指藻作為目標(biāo)生物,研究萘對三角褐指藻的毒性效應(yīng),探討萘對其葉綠素含量、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量等生化指標(biāo)的影響,并同步測定了外源萘在海水中的濃度變化趨勢,旨在探索檢測海洋生態(tài)系統(tǒng)溢油污染的生態(tài)指標(biāo),并為揭示該類化合物對海洋三角褐指藻的毒性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 藻種培養(yǎng)條件

實驗所用海洋三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)購自于青島中國海洋大學(xué).實驗前,接種3~4次使細(xì)胞達(dá)到同步培養(yǎng).

藻種于 SPX-300I-C型人工氣候箱中培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為(24±1)℃,光照強(qiáng)度為 4000lx,光暗比為12h:12h.培養(yǎng)液選用f/2營養(yǎng)鹽配方[7],實驗海水取自渤?？?鹽度為32.0±0.1,pH值為7.6±0.2),經(jīng) 0.45μm 濾膜抽濾煮沸消毒,冷卻后配制培養(yǎng)液,每天定時人工搖動3次.

1.2 試劑與儀器

萘(純度≥99.8%)購自北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司.配制40g/L的萘的二甲基亞砜(DMSO) (色譜純)儲備液,封口膜密封,每一個月重新配制一次.試驗工作溶液均是當(dāng)天配制.

Waters高效液相色譜儀(HPLC):(Waters 1525 Binary HPLC Pump,Waters 717 plus Auto sampler,Waters 2487 UV Detector)、SPX-300I-C型人工氣候箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、Universal 32R高速冷凍離心機(jī)(德國)、SHB-IIIS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司).

1.3 試驗設(shè)計和方法

以DMSO作為助溶劑,試驗處理組分別為含0.048,0.096,2,8,16,32,64mg/L萘濃度的 f/2培養(yǎng)液, 以不添加萘的 f/2培養(yǎng)液作為對照 (預(yù)實驗結(jié)果表明,DMSO對藻類的生長影響不大,無顯著性差異(P<0.01),結(jié)果與以往研究結(jié)果[8]類似).同時,預(yù)實驗結(jié)果表明完全封閉的環(huán)境不利于藻類的呼吸作用,本試驗中綜合考慮到藻類呼吸作用和萘的揮發(fā),采用硅膠塞塞住三角瓶口,并用封口膜封住,外層再覆一層保鮮膜[9].

培養(yǎng)液體積均為150mL,置于光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行一次性培養(yǎng),按1:4的比例接種.每個萘濃度組設(shè)置 3個平行,分別在 0,24,48,72,96,120,144, 168h進(jìn)行取樣測定相關(guān)生理生化指標(biāo).

1.3.1 海洋三角褐指藻光密度測定 采用TU-1901雙光束紫外可見分光光度計,在683nm處測定光密度 OD683nm,建立海洋三角褐指藻細(xì)胞密度Y和光密度X之間的線性關(guān)系(Y=-43.5+ 1058.6X,r2=0.9932).以式(1)[10]藻細(xì)胞生長抑制率計算萘對海洋三角褐指藻的毒性效應(yīng).

式中: Ct0表示 t時刻空白培養(yǎng)液藻細(xì)胞光密度; Ct表示t時刻含萘培養(yǎng)液中藻細(xì)胞的光密度.

1.3.2 葉綠素的提取與含量的測定 用分光光度法測定藻色素含量[11].每隔24h取20mL藻液,使用孔徑為 0.45μm的醋酸纖維濾膜(?50cm)抽濾,將濾膜放入10mL具塞離心管中,加入分析純95%乙醇 10mL,蓋上塞子,于 78℃水浴中加熱5min并搖動數(shù)次,冷卻后室溫置于黑暗條件下靜置24h,取出后以4000 r/min離心15min,上清液倒入 1cm玻璃比色皿,以 95%乙醇作參比,在470nm、649nm和664nm波長下測定吸光度,根據(jù)式(2)~式(4)[12]計算出葉黃素和胡蘿卜素含量.

1.3.3 酶活測定 提取粗酶液:取50mL藻液放入離心管(50mL)中,4000r/min離心20min,棄上清液,用預(yù)冷的 0.05mol/L(pH7.0)磷酸緩沖液淋洗藻沉淀并轉(zhuǎn)入預(yù)冷的研缽中,加入少量石英砂冰浴研磨.接著用 0.05mol/L(pH7.0)磷酸緩沖液,將勻漿液沖洗入 10mL離心管中,并定容至 5mL. 8000r/min離心 20min,上清液即為所需粗酶液,置于-80℃冰箱中保存待測.

超氧化物岐化酶(SOD)[13]測定:采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化學(xué)還原反應(yīng)法,反應(yīng)總體積為 5mL,其中 5×10-3mol/L 磷酸緩沖溶液(pH 7.8), 75×10-6mol/L氮藍(lán)四唑,13×10-3mol/L蛋氨酸, 2×10-6mol/L核黃素,1×10-6mol/L Na2EDTA;藻細(xì)胞酶提取液0.2ml,4000lx日光下反應(yīng)20min后于560nm測定其吸光度.SOD計算如式(5).

丙二醛(MDA)[14]含量的測定:1.5mL酶液中加入0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液3mL,振蕩混合后于 100℃沸水浴上反應(yīng) 30min,迅速冷卻后4000r/min離心 10min,上清液分別于 450,532, 600nm 波長下測定 OD 值.對照以 1.5mL 0.05mol/L pH 7.8的磷酸緩沖液代替酶液.MDA數(shù)量以umol/細(xì)胞數(shù)量表示.

MDA(μmol/L)=6.45×(OD532-OD600)-0.56×OD450

1.4 萘濃度的測定

取5mL藻液,過0.45μm孔徑的醋酸纖維濾膜,濾液用 Waters高效液相色譜儀.色譜柱為Inertsil ODS-3 5μm×2.1mm×250mm,進(jìn)樣量為20μL,柱溫 40℃,流速為 0.4mL/min,流動相為乙腈:水=65:35(V:V),檢測波長 254nm,保留時間為6.856min.空白海水進(jìn)樣測定萘濃度,結(jié)果表明采取的海水中萘濃度低于檢測限0.01×10-6.

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

利用 SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,包括平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及單因素方差分析(LSD比較),統(tǒng)計性顯著性假設(shè)為P<0.05.

2 結(jié)果與討論

2.1 萘對海洋三角褐指藻生長的影響及EC50

由圖1可見,與對照組相比,各萘濃度試驗組中藻細(xì)胞的生長均受到不同程度的抑制.在低濃度萘(初始濃度為 0.048,0.096,2mg/L)暴露下,海洋三角褐指藻的吸光度變化趨勢與對照組相近,受抑制作用不明顯.但當(dāng)萘濃度達(dá)到8mg/L時,藻細(xì)胞受抑制程度隨著萘濃度的升高而增大.

由圖1數(shù)據(jù)計算得到不同濃度萘對海洋三角褐指藻的生長抑制率.結(jié)果表明,隨著萘濃度的增大,萘對海洋三角褐指藻的抑制率也不斷增大,抑制作用達(dá)90%以上的初始萘濃度為64mg/L.低濃度(初始濃度為0.048,0.096,2mg/L)萘暴露下,其最大抑制率僅為 17.19%,當(dāng)萘初始濃度分別為8,16,32mg/L時,其最大抑制率達(dá)到 37.66%、55.40%和70.35%.同時,基本上所有濃度組抑制作用都在 48h時達(dá)到最大,然而隨著時間的繼續(xù)延長,抑制作用逐漸變小.這一方面可能與萘本身的強(qiáng)揮發(fā)性有關(guān),另一方面也與藻類自身的恢復(fù)作用有關(guān)[9].萘的急性毒性效應(yīng)在 48h時最為明顯.初始萘濃度64mg/L組除外,其抑制作用并沒有隨著時間的延長而減弱,可能是因為高濃度萘已經(jīng)對海洋三角褐指藻造成了不可恢復(fù)的損傷作用.

圖1 不同濃度萘對海洋海洋三角褐指藻吸光度的影響Fig.1 Effects of various concentration of Naphthalene on the absorbance of Phaeodactylum tricomutum

經(jīng)概率單位-濃度對數(shù)法計算各時間點萘對海洋三角褐指藻的半數(shù)有效量即EC50,如圖2所示,在24h時萘的EC50值最大,達(dá)到19.1849mg/L.原因可能是萘此時還沒有與海洋三角褐指藻充分接觸,毒性作用還不顯著.而在 48h時,萘的EC50值僅為0.9463mg/L,主要是因為萘自身的強(qiáng)揮發(fā)性以及萘對海洋三角褐指藻的急性毒性作用已經(jīng)得到體現(xiàn).這說明雖然萘自身的強(qiáng)揮發(fā)性會導(dǎo)致處理組中萘濃度不斷減少,但是監(jiān)測短期(約48h)內(nèi)高強(qiáng)度萘暴露下對海洋三角褐指藻在168h時的中長期毒性影響是非常有現(xiàn)實意義的.同時在 48h以后的各個時間點監(jiān)測值總體呈減小趨勢,但值略有波動,說明在1周的慢性毒性作用過程中,雖然萘濃度由于強(qiáng)揮發(fā)性而不斷降低,但萘對海洋三角褐指藻的慢性毒性效應(yīng)卻越來越顯著,并且在 168h EC50值最低,僅為0.2669mg/L,波動的原因可能是隨著時間的延長海洋三角褐指藻對萘漸漸產(chǎn)生了弱耐藥性.

圖2 萘的EC50變化趨勢Fig.2 The variation trend of EC50 of Naphthalene

圖3 萘對海洋三角褐指藻葉黃素和胡蘿卜素含量的影響Fig.3 Effects of Naphthalene on xanthophyll and carotene content of Phaeodactylum tricomutum

本實驗中,在萘暴露下,海洋微藻海洋三角褐指藻表現(xiàn)出較為明顯的濃度-效應(yīng)相關(guān)性.當(dāng)毒物濃度較低時(

2.2 萘對海洋三角褐指藻光合作用色素的影響

由圖3可見, 萘濃度小于2mg/L時,葉黃素和胡蘿卜素含量與對照組相比無顯著性差異,尤其是萘初始濃度為0.048, 0.096mg/L時,雖然這2個濃度組對海洋三角褐指藻生物量有抑制效應(yīng),是對葉黃素和胡蘿卜素產(chǎn)生輕度的刺激作用.當(dāng)萘初始濃度達(dá)到8mg/L甚至更高時,海洋三角褐指藻的葉黃素和胡蘿卜素含量隨著萘濃度的增大而下降,當(dāng)萘初始濃度為 64mg/L時,其含量在與萘接觸的 24h后即為0,海洋三角褐指藻的光合作用色素此時已遭到徹底破壞.

2.3 對SOD活性的影響和MDA含量的變化

由圖 4可知,在 168h時,初始萘濃度分別為0,0.048,0.096mg/L時,海洋三角褐指藻SOD活性并沒有顯著差異(P<0.05);萘初始濃度為2mg/L時,海洋三角褐指藻168h的SOD活性最強(qiáng),并與其他處理組差異明顯(P<0.05),萘濃度為8mg/L時,SOD活性急劇下降,而當(dāng)萘初始濃度達(dá)到 16, 32,64mg/L時, 168h-SOD活性降至接近0,且濃度間沒有顯著差異(P<0.05).可見,168h的SOD活性呈現(xiàn)出低萘初始濃度上升,高萘初始濃度時下降的趨勢.

圖4 168h時在萘暴露下海洋三角褐指藻SOD的活性Fig. 4 Effects of Naphthalene on SOD activity of Phaeodactylum tricomutum at 168h

丙二醛(MDA)含量的高低可以反映細(xì)胞膜脂過氧化的程度.如圖 5所示,在萘脅迫下,在0~8mg/L濃度范圍時,MDA含量變化不明顯,且各處理組海洋三角褐指藻 MDA含量并沒有顯著差異(P<0.05);而當(dāng)萘初始濃度達(dá)到 16,32, 64mg/L時,海洋三角褐指藻的168h的MDA含量急劇增加,且各處理組間差異顯著(P<0.05),說明隨著萘初始濃度的不斷增加,其對海洋三角褐指藻的膜脂過氧化造成了不同程度的加劇,并導(dǎo)致細(xì)胞受到不同程度的損害.

圖5 168h時在萘暴露下海洋三角褐指藻MDA的含量Fig.5 Effects of Naphthalene on MDA content of Phaeodactylum tricomutum at 168h不同字母表示差異顯著

近幾年來,植物體內(nèi)有效清除活性氧的保護(hù)機(jī)制得到了廣泛深入的研究,而其中 SOD、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)等作為植物體內(nèi)清除活性氧、保護(hù)植物細(xì)胞免受傷害的保護(hù)性酶更是研究的重點[16-19].研究結(jié)果表明,植物體內(nèi)在受到輕度的環(huán)境脅迫時,SOD活性會有所升高,以增強(qiáng)其對活性氧的清除能力;但是這些酶的含量和活性都在一定的毒物范圍內(nèi)升高,當(dāng)細(xì)胞受到重度逆境脅迫時它們的含量活性又會急劇下降,造成活性氧的積累和細(xì)胞的傷害[20].在本實驗中,對于SOD的研究也有類似的實驗結(jié)果.在萘的低濃度組(0.048~2mg/L)中, SOD活性受到明顯誘導(dǎo),并隨著毒物濃度增大而升高,此時MDA作為膜脂過氧化物相應(yīng)地有所降低;隨著毒物濃度的繼續(xù)增加,SOD受脅迫導(dǎo)致其合成或結(jié)構(gòu)受破壞而引起活力下降,藻清除活性氧的能力亦下降,膜脂過氧化進(jìn)一步加劇,超過了細(xì)胞的耐受極限時,膜脂過氧化帶來的損傷大于細(xì)胞自身的修復(fù)能力,SOD活性顯著下降并漸漸失活,自由基產(chǎn)生和消除之間的平衡被破壞,細(xì)胞開始受到毒害,海洋三角褐指藻生長也明顯受到抑制.SOD呈現(xiàn)低濃度誘導(dǎo),高濃度抑制現(xiàn)象,即表現(xiàn)為“鐘形曲線”.這種現(xiàn)象在其他毒物的藻類實驗中也有類似的結(jié)果[21-23].

暴露在毒物下的生物體,一旦受到毒物脅迫,便自發(fā)的開始對這些毒物展開解毒過程[24].其細(xì)胞內(nèi)外均會發(fā)生一系列的生理生化反應(yīng),原有的平衡被打破,新的平衡開始逐漸建立.這其中細(xì)胞內(nèi)自由基含量以及MDA、SOD等含量的變化各有其特點和趨勢,在研究中找出其中的聯(lián)系對于揭示該類化合物對藻的毒性機(jī)制有重要作用.

2.4 萘濃度的同步變化

圖6 萘濃度隨時間的變化Fig.6 The changes of concentration of naphthalene with time with initial concentration of naphthalene at 0.048, 0.096, 2, 8,16,32,64mg/L, respectively

由圖6可見,萘的損失主要是由于自身的強(qiáng)揮發(fā)性,在 168h后,所有濃度組中萘的濃度均低于 0.5mg/L,即使是最大的萘濃度組,其濃度也只有0.3568mg/L.同時,在120h后0.048,0.096mg/L這 2個濃度組中的萘均已揮發(fā)至 0.并且,以DMSO作為助溶劑的萘在海水培養(yǎng)基中的溶解度依然很低,這7個濃度組的萘初始真實濃度由低到高分別僅有 0.0292,0.0431,0.9680,2.9281, 5.8809,12.2743,13.5793mg/L.

3 結(jié)論

3.1 隨著萘濃度的增大,其對海洋三角褐指藻生長的抑制較為明顯,該效應(yīng)表現(xiàn)出一定的濃度和時間相關(guān)性.在0~168h內(nèi),低濃度組萘(初始濃度為 0~2mg/L)中葉黃素和胡蘿卜素含量與對照組相比無明顯差異.但當(dāng)污染物初始濃度達(dá)到8mg/L甚至更大時,葉黃素和胡蘿卜素含量隨毒物濃度增加而迅速下降,呈現(xiàn)一定的濃度-效應(yīng)關(guān)系.SOD活性變化隨毒物濃度升高,呈現(xiàn)先升高后下降的“鐘形曲線”.MDA的含量隨毒物濃度先略下降而后急劇上升.

3.2 在 0~168h內(nèi),萘濃度的損失主要是由于自身極強(qiáng)的揮發(fā)性.120h時,初始濃度為0.048mg/L和0.096mg/L 2個濃度組中萘濃度均揮發(fā)至0,且在 168h后,所有濃度組中萘的濃度均低于0.5mg/L.同時,以DMSO作為助溶劑的萘在海水培養(yǎng)基中的溶解度依然很低,最高濃度組萘的監(jiān)測值也僅有13.5793mg/L.

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Toxic effects of naphthalene on the growth of Phaeodactylum tricomutum and relevant biochemical indexes.

LI Yan-mei, ZENG Wen-lu, YU Qiang, ZHOU Qi-xing*(Key Laboratory of Pollution Processes and Environmental Criteria, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control, College of Environmental Science and Engineering, Nankai University, Tianjin 300071, China). China Environmental Science, 2012,32(1)：150~155

Phaeodactylum tricomutum was selected as target organism to study the toxicity of naphthalene under various concentration. From 0h to 168h, the optical absorbance, xanthophyll and carotene content had no obvious difference with blank control in low-concentration groups of naphthalene (0.048~2mg/L). However, when the concentration of naphthalene reached 8mg/L or more, dramatically decreases of the optical absorbance, xanthophyll and carotene content were gained. Activities of superoxide dismutase(SOD) increased at first and then decreased remarkably with the increasing concentration of naphthalene, showed as “Bell Shaped Curve”. And the content of malondialdehyde(MDA) decreased slightly and then flared up and lipid peroxidant aggregated with the increasing concentration of naphthalene.

water pollution；marine Phaeodactylum tricomutum；naphthalene；toxic effect

2011-03-23

國家自然科學(xué)基金資助項目(21077059,40930739);國家海洋局海洋溢油鑒別與損害評估技術(shù)重點實驗室2010年度開放基金項目(201008)

* 責(zé)任作者, 教授, zhouqx523@yahoo.com

X171.5

A

1000-6923(2012)01-0150-06

李艷梅(1987-)女,南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院碩士研究生,主要研究方向為生態(tài)毒理.發(fā)表論文4篇.