正交實(shí)驗(yàn)選擇纖維素酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件

黃蓉姿,萬(wàn)金泉,馬邕文,黃明智,3,楊漪清 (.華南理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 50006；2.華南理工大學(xué)工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 50006；3.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,廣東 廣州 5064)

正交實(shí)驗(yàn)選擇纖維素酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件

黃蓉姿1,2,萬(wàn)金泉1*,馬邕文1,黃明智1,3,楊漪清1(1.華南理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006；2.華南理工大學(xué)工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510006；3.華南理工大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院,廣東 廣州 510641)

在復(fù)合碳源、30℃恒溫培養(yǎng)條件下,用正交實(shí)驗(yàn)法對(duì)影響纖維素酶產(chǎn)生菌降解纖維素的 5種單因素培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,并將優(yōu)化得到的條件應(yīng)用于厭氧-好氧廢水處理系統(tǒng).結(jié)果表明,MgSO4用量等單因素對(duì)纖維素酶活性以及纖維素降解率有不同程度的促進(jìn)作用;正交實(shí)驗(yàn)得到厭氧菌和好氧菌的最佳培養(yǎng)條件不完全一致;在廢水處理系統(tǒng)中,5種單因素的最佳綜合水平為:30mg/L MgSO4,20mg/L CoCl2,CNP配比為400:5:1,氮源為NH4Cl (28.7mg/L), pH=7.0,此時(shí)厭氧菌及好氧菌酶活性分別為4801U/L和4794U/L,酶穩(wěn)定性分別達(dá)到91.0%和95.5%,纖維素降解率為31.9%和28.4% .

正交實(shí)驗(yàn)；酶活性；酶穩(wěn)定性；纖維素降解率

造紙行業(yè)會(huì)產(chǎn)生大量含纖維素的廢水,機(jī)械過(guò)濾只能去除其中不溶解的、粒徑較大的雜質(zhì),仍有一些細(xì)小纖維進(jìn)入后續(xù)的生物處理過(guò)程中[1].生物處理可以有效降低纖維素廢水的污染物負(fù)荷,提高廢水的可生化性[2].纖維素的生物降解依賴于纖維素酶產(chǎn)生菌的生理過(guò)程,受系統(tǒng)環(huán)境因素影響很大[3],因此尋找最佳的產(chǎn)酶條件成了眾多學(xué)者關(guān)注的問(wèn)題.但目前纖維素酶在環(huán)境領(lǐng)域的研究主要集中在降解固體廢物中的纖維素方面[4-5],很少見(jiàn)到纖維素酶在廢水處理系統(tǒng)中的報(bào)道.

為了強(qiáng)化造紙廢水細(xì)小纖維的生物降解過(guò)程,縮短廢水處理周期,本研究在以前選定的碳源和溫度條件[6]下,考察另外 5種單因素綜合培養(yǎng)條件下對(duì)纖維素酶產(chǎn)生菌的調(diào)控作用,包括MgSO4用量、CoCl2用量、CNP配比、氮源組成以及pH值等.由于影響因素較多,通過(guò)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn) L16(45),在一定程度上避免了選擇最佳培養(yǎng)條件的盲目性.

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)采用的厭氧菌和好氧菌為復(fù)合菌,取自實(shí)驗(yàn)室生物掛膜的厭氧-好氧折流式工藝反應(yīng)器裝置.接種污泥取自廣州市獵德污水處理廠的二沉池,馴化期間采用葡萄糖和纖維素廢水混合作為基質(zhì)[7].

基礎(chǔ)培養(yǎng)溶液為:葡萄糖(第 1碳源): 600mg/L,少量 NaHCO3、CaCl2、MnSO4、Fe2(SO4)3、ZnCl2等無(wú)機(jī)鹽.以上述溶液為基礎(chǔ),依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)分配分別加入不同組分或改變某些組分的用量(表1),配成不同正交組液體培養(yǎng)基.

表1 各因素的水平列表Table 1 List of factors’ levels

微晶纖維素(MCC),購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,粉碎過(guò)200目篩.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 采用2個(gè)為一組的200mL搖瓶模擬厭氧-好氧反應(yīng)器,每隔12h更新各搖瓶中的培養(yǎng)液,厭氧瓶的用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行更新,好氧瓶的用停留厭氧瓶12h后的培養(yǎng)基進(jìn)行更新.各搖瓶裝40mL培養(yǎng)液、100mg微晶纖維素(第2碳源),將20mL厭氧或好氧菌懸液接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基,然后置于30℃振蕩培養(yǎng)箱(厭氧108r/min,好氧180r/min)中培養(yǎng)5d ,測(cè)定厭氧菌、好氧菌的纖維素酶活性以及纖維素降解率.依照 5因素 4水平正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)(表2),共有16組厭氧-好氧實(shí)驗(yàn),均做平行實(shí)驗(yàn).

將正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件應(yīng)用于厭氧-好氧折流式反應(yīng)器,培養(yǎng)5d,取出生物膜,制成菌懸液,測(cè)定系統(tǒng)中厭氧菌、好氧菌的纖維素酶活性、酶穩(wěn)定性以及纖維素降解率.

1.2.2 酶活性測(cè)定 纖維素的最終酶解產(chǎn)物是葡萄糖,通過(guò)測(cè)定底物酶解后的葡萄糖生成量來(lái)表征纖維素酶活性,本實(shí)驗(yàn)采用離子色譜法測(cè)定葡萄糖含量.具體方法為:培養(yǎng)結(jié)束后,從各搖瓶中取出上清液,并用 0.22μm的水相濾膜過(guò)濾,測(cè)定葡萄糖濃度,作為實(shí)驗(yàn)的空白值 C0;另取新的試管,加入5mL培養(yǎng)后的菌懸液、10mg微晶纖維素、5mL檸檬酸緩沖液,在50℃水浴中保溫1h,反應(yīng)后取出溶液,并用 0.22μm的水相濾膜過(guò)濾,測(cè)定葡萄糖濃度C.

離子色譜條件:離子色譜儀:DIONEX ICS –3000;分析柱:CarboPac PA1(2@250mm);保護(hù)柱: CarboPac PA1 (2@50mm);淋 洗 液 : 0.001molNaOH-0.05molNaAC;體 積 流 量 : 0.500mL/min;進(jìn)樣體積:10μL;柱溫:30e;檢測(cè)器:脈沖安培檢測(cè)器,金電極.

1.2.3 纖維素酶活性的定義及計(jì)算 纖維素酶活性定義:以底物在50℃,pH4.8,恒溫一定時(shí)間的條件下,以水解反應(yīng)中每克懸浮固體每小時(shí)催化底物水解形成 1.0mg葡萄糖的酶量定義為一個(gè)活力單位,用U表示.酶活的計(jì)算公式為:x = (C –C0)/(MLSS?T),式中:x為纖維素酶活性, U;C為樣品的葡萄糖濃度,C0為空白實(shí)驗(yàn)的葡萄糖濃度,mg/mL;MLSS為混合液懸浮固體濃度,g/mL;T為反應(yīng)時(shí)間,h.

1.2.4 酶穩(wěn)定性測(cè)定 取完成培養(yǎng)的生物膜樣品,制成菌懸液,用甲苯進(jìn)行滅菌,室溫保存 4h,測(cè)定纖維素酶的殘余酶活性,以 0h酶活性為標(biāo)準(zhǔn)(100%)計(jì)算相對(duì)酶活性.

1.2.5 纖維素降解率測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8],培養(yǎng)結(jié)束后,倒掉上清液,用蒸餾水輕輕洗去菌體,將固形物置于60℃烘箱中烘至恒重,用電子天平分別稱量未被降解的微晶纖維素質(zhì)量,記為 Wi(g),培養(yǎng)前的微晶纖維素質(zhì)量記為 W0(g),則降解率η=(W0-W1) /W0×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 5因素4水平正交實(shí)驗(yàn)分配與結(jié)果

由表 2可見(jiàn),無(wú)論是厭氧段還是好氧段, MgSO4用量、CoCl2用量、CNP配比、氮源組成、pH值5種因素在單因素條件下對(duì)纖維素酶產(chǎn)生菌的產(chǎn)酶和降解能力均有一定的促進(jìn)作用.

表2 5因素4水平正交實(shí)驗(yàn)分配及結(jié)果Table 2 Disposition and result of orthogonal experimental design L16(45)

2.1.1 厭氧菌產(chǎn)酶及降解能力 由表 3、表 4可見(jiàn),厭氧菌產(chǎn)酶及降解效果最佳的實(shí)驗(yàn)條件組合完全一致,均為 A4B4C4D3E2,即:厭氧菌在30mg/L MgSO4、30mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、CO(NH2)2:NH4Cl=1:2的混合氮源、pH6.0時(shí),纖維素酶活性最高,纖維素降解率最大.

根據(jù)極差分析各因素對(duì)酶活性變化影響大小的順序?yàn)镸gSO4＞氮源組成＞CoCl2＞CNP配比＞pH值,而對(duì)降解率變化的影響順序?yàn)镸gSO4＞ 氮源組成 ＞ CNP配比 ＞ CoCl2＞ pH值,可見(jiàn)5種因素中,影響厭氧段纖維素酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)代謝的主要因素是MgSO4和氮源組成,而pH值對(duì)酶活性和降解率影響較小,可能是產(chǎn)纖維素酶的厭氧微生物在這4種pH值條件下生長(zhǎng)狀況相似的緣故.何品晶等[9]通過(guò)研究pH值對(duì)有機(jī)垃圾厭氧水解的影響,發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液的pH值為5～7時(shí)有利于顆粒態(tài)有機(jī)物的水解.

表3 厭氧菌酶活性(U/L)Table 3 Enzyme activity of anaerobe (U/L)

表4 厭氧段纖維素降解率(%)Table 4 Degradation-rate of cellulose in anaerobic stage(%)

2.1.2 好養(yǎng)菌產(chǎn)酶及降解能力 由表 5、表 6可見(jiàn),好氧菌產(chǎn)酶效果最佳的實(shí)驗(yàn)條件組合為A4B3C4D2E3,而 降 解 效果 最 佳 的 組 合 為A4B3C4D3E3,兩者非常接近,僅在氮源組成上有差別,分別為CO(NH2)2: NH4Cl＝0∶3和CO(NH2)2: NH4Cl＝1∶2,其他條件組合為30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、pH=7.0.

各因素對(duì)酶活性變化影響的順序?yàn)镃NP配比 ＞ pH 值＞ CoCl2＞ MgSO4＞ 氮源組成,而對(duì)降解率變化的影響順序?yàn)镃NP配比 ＞ pH 值＞MgSO4＞ CoCl2＞ 氮源組成,可見(jiàn)在5種因素中,影響好氧段纖維素酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)代謝的主要因素是CNP配比和pH值.而氮源組成對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不大;同時(shí)經(jīng)F檢驗(yàn),氮源組成對(duì)酶活性和降解率的影響也不顯著.

表5 好氧菌酶活性(U/L)Table 5 Enzyme activity of aerobe (U/L)

表6 好氧段纖維素降解率(%)Table 6 Degradation-rate of cellulose in aerobic stage(%)

2.1.3 正交實(shí)驗(yàn)各因素的影響 由圖 1、圖 2可見(jiàn),無(wú)論是厭氧菌還是好氧菌,它們各自的因素-指標(biāo)趨勢(shì)基本吻合,即同一因素水平條件下的酶活性與降解率呈現(xiàn)出較好的對(duì)應(yīng)關(guān)系,這也說(shuō)明纖維素類物質(zhì)的降解主要依靠微生物分泌的纖維素酶進(jìn)行[10].

金屬離子是微生物生長(zhǎng)必不可少的一類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[11],而且厭氧過(guò)程中缺乏微量金屬營(yíng)養(yǎng)元素產(chǎn)生的不利影響比好氧過(guò)程要大[12].對(duì)比圖 1與圖 2,Mg2+的作用趨勢(shì)幾乎相同,都在30mg/L時(shí)達(dá)到最佳效果;但厭氧菌和好氧菌對(duì)于 Co2+的濃度要求存在較大差異,主要是20,30mg/L,說(shuō)明不同微生物對(duì) Co2+的濃度要求不同.李德瑩等[13]研究金屬離子對(duì)纖維素酶活力的影響發(fā)現(xiàn),Mg2+、Co2+離子濃度在一定范圍內(nèi),對(duì)纖維素酶活性有激活作用,Mg2+、Co2+分別在1.2、0.2mg/mL時(shí),酶活性達(dá)到峰值,濃度增大表現(xiàn)出抑制作用.相比之下,本研究金屬離子作用濃度較低.

圖1 厭氧段各因素的作用趨勢(shì)Fig.1 Effect of different factors in anaerobic stage

圖2 好氧段各因素的作用趨勢(shì)Fig.2 Effect of different factors in aerobic stage

厭氧菌和好氧菌均在400:5:1的CNP配比下生長(zhǎng)良好,酶活性和降解率達(dá)到較高水平.這個(gè)比例與經(jīng)驗(yàn)值(厭氧條件下 200:5:1及好氧條件下100:5:1)略有出入,說(shuō)明微生物對(duì)碳源的需求和競(jìng)爭(zhēng)增大,可能跟系統(tǒng)中的微生物種類有關(guān)系,有待進(jìn)一步的研究.

由圖1、圖2可以看出,氮源組成對(duì)厭氧菌影響顯著,對(duì)好氧菌影響甚小.但對(duì)于氮源組成的要求,兩者都偏向無(wú)機(jī)氮源比例較大的混合氮源,即CO(NH2)2: NH4Cl＝1∶2.相對(duì)來(lái)說(shuō),無(wú)機(jī)氮源比有機(jī)氮源更好,因?yàn)橛袡C(jī)氮源同時(shí)作為碳源,有可能優(yōu)先于纖維素被利用,一定程度上妨礙了纖維素的降解[14].殷中偉等[15]、徐昶等[16]通過(guò)研究不同氮源對(duì)纖維素降解菌產(chǎn)酶的影響發(fā)現(xiàn),以硝酸鹽為無(wú)機(jī)氮源時(shí)酶活力最高.

本實(shí)驗(yàn)得出pH6.0、pH7.0分別適合厭氧菌、好氧菌的生長(zhǎng),在中性偏酸及中性的條件下表現(xiàn)出較高的酶活性和降解能力.pH值通過(guò)影響微生物群落結(jié)構(gòu)的變化影響有機(jī)物的代謝過(guò)程.葉凝芳等[17]通過(guò)Shannon指數(shù)分析表明,pH 7或8時(shí)的微生物多樣性較高.一般情況下,生物多樣性越高,其代謝關(guān)系越復(fù)雜,結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定,對(duì)污染物的協(xié)同作用能力也越大[10].何品晶等[9]認(rèn)為,在pH值為5、6、7、8條件下,微生物處于靜止生長(zhǎng)期時(shí),水解速率常數(shù)處于同一個(gè)數(shù)量級(jí),且發(fā)酵液pH7時(shí)最有利于微生物的合成代謝.

2.2 纖維素降解菌的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件

由于以上的搖瓶模擬實(shí)驗(yàn)得出厭氧菌產(chǎn)酶及降解效果最佳、好氧菌產(chǎn)酶效果最佳、好氧菌降解效果最佳的3種條件組合(表7),彼此間略有差異,為進(jìn)一步得到廢水處理系統(tǒng)中纖維素酶產(chǎn)生菌的最優(yōu)綜合培養(yǎng)條件,將優(yōu)化得到的3種組合分別應(yīng)用于厭氧-好氧折流式反應(yīng)器,考察系統(tǒng)中厭氧菌、好氧菌的纖維素酶活性、酶穩(wěn)定性以及纖維素降解率.

由表8可見(jiàn),實(shí)驗(yàn)2的培養(yǎng)條件比較理想,因?yàn)閰捬蹙秃醚蹙a(chǎn)酶比較均衡,且酶穩(wěn)定性較高,對(duì)纖維素的降解效果明顯.實(shí)驗(yàn)2和實(shí)驗(yàn)3的培養(yǎng)條件僅在氮源組成上有差別,而實(shí)驗(yàn)2得到的厭氧菌和好氧菌酶活性都高于實(shí)驗(yàn) 3,分別提高到1.12倍和1.72倍,纖維素降解率分別提高了2.5%和 11.7%,說(shuō)明無(wú)機(jī)氮更容易被微生物吸收利用,廢水生化處理系統(tǒng)中適當(dāng)濃度的氨氮對(duì)厭氧微生物的生長(zhǎng)有刺激作用[18].實(shí)驗(yàn)1的酶穩(wěn)定性較低,可能是Co2+的濃度偏高,不利于底物與酶活性中心的結(jié)合,導(dǎo)致酶活性隨時(shí)間變化呈下降趨勢(shì).

表7 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到的培養(yǎng)條件Table 7 Culture conditions optimized by orthogonal experiments

表8 三種培養(yǎng)條件下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 8 Results under three kinds of culture conditions

本研究得到的纖維素降解率不到 40%,理論上還有一定的提升空間.纖維素的降解需要多種酶的協(xié)同作用,今后可以考慮在廢水生化處理系統(tǒng)中加入人工篩選的優(yōu)勢(shì)菌,構(gòu)建產(chǎn)多種纖維素酶的高效穩(wěn)定復(fù)合菌系[19],提高纖維素的處理率.

3 結(jié)論

3.1 厭氧菌產(chǎn)酶及降解效果最佳的實(shí)驗(yàn)條件組合一致,均為30mg/L MgSO4、30mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、CO(NH2)2:NH4Cl=1:2的混合氮源、pH6.0.

3.2 好氧菌產(chǎn)酶效果最佳的實(shí)驗(yàn)條件組合為30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、氮源為NH4Cl,pH7.0,而降解效果最佳的組合為30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、CO(NH2)2: NH4Cl=1:2的混合氮源、pH7.0.

3.3 在厭氧-好氧廢水處理系統(tǒng)中,當(dāng)培養(yǎng)條件為 30mg/L MgSO4、20mg/L CoCl2、CNP比為400:5:1、氮源為NH4Cl (28.7mg/L)、pH7時(shí),微生物的產(chǎn)酶和降解效果最佳,厭氧菌及好氧菌酶活性分別為4801 U/L、4794U/L,酶穩(wěn)定性分別達(dá)到 91.0%、95.5%,纖維素降解率為 31.9%和28.4%.

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Optimization of synthetic culture condition of cellulase producing strains using orthogonal experimental design.

HUANG Rong-zi1,2, WAN Jin-quan1*, MA Yong-wen1, HUANG Ming-zhi1,3, YANG Yi-qing1(1.College of Environmental Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；2.Key Laboratory of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, Ministry of Education, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；3.School of Chemistry and Chemical Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510641,China). China Environmental Science, 2012,32(1)：130～135

The five single factors for cellulose biodegradation ability of cellulase producing strains were optimized by orthogonal experiments using mixed carbon source under 30°C, and were used in wastewater treatment system with anaerobic and aerobic processes. Five single culture factors promoted cellulase activity and cellulose degradation-rate in varying degrees. Moreover, the optimal culture conditions of anaerobe obtained through orthogonal experiments were not in accordance with that of aerobe. In the wastewater treatment system, the optimal synthetic condition was MgSO4of 30mg/L, CoCl2of 20mg/L , the ratio of CNP of 400:5:1, NH4Cl (of 28.7mg/L) as nitrogen source and pH7.0 . The cellulase activities (CA), enzymatic stabilities (ES), and cellulose degradation-rates (CDR) of anaerobe and aerobe were as follows: CA: 4801U/L, 4794U/L; ES: 91.0%, 95.5%; CDR: 31.9%, 28.4% .

orthogonal experiment；enzyme activity；enzymatic stability；cellulose degradation rate

2011-04-25

廣東省首批“節(jié)能減排”重大專項(xiàng)“造紙廢水循環(huán)利用新技術(shù)集成與示范”(2008A080800003);廣東省自然科學(xué)基金(S2011040000389);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助(2011ZM0049)

* 責(zé)任作者, 教授, ppjqwan@scut.edu.cn

X172

A

1000-6923(2012)01-0130-06

黃蓉姿(1986-),女,廣東汕頭人,華南理工大學(xué)碩士研究生,主要從事工業(yè)廢水生物處理的研究.發(fā)表論文1篇.