MTA1在胃癌細(xì)胞系和胃癌組織中的表達(dá)定位以及臨床意義

姚遠(yuǎn)，李艷，趙鴻梅

(遼寧省人民醫(yī)院消化內(nèi)一科，遼寧沈陽 110016)

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，在國內(nèi)不少地區(qū)的惡性腫瘤死亡統(tǒng)計(jì)中占首位或第2位［1］。腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(MTA)是最新發(fā)現(xiàn)的與癌癥進(jìn)展相關(guān)的一個(gè)家族，MTA家族的成員包括3種不同的基因(MTA1、MTA2和 MTA3)和已經(jīng)報(bào)道的6種亞型(MTA1、MTA1s、MTA1-ZG29p、MTA2、MTA3 和 MTA3L)［2］。MTA1是這個(gè)家族中首先被發(fā)現(xiàn)的，已經(jīng)報(bào)道許多人類的腫瘤中MTA1高表達(dá)［3］，例如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃腸系統(tǒng)癌癥和結(jié)腸直腸癌［4-10］。本研究主要探討胃癌細(xì)胞系以及胃癌臨床標(biāo)本中MTA1的表達(dá)情況，以及MTA1在胃癌細(xì)胞中的定位情況，為胃癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Protein marker購自GenScript公司;MTA1抗體購自Santa公司;HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;Alexa Fluor 488、DAPI購自Invitrogen公司，ECL發(fā)光試劑盒購自GE Healthcare公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

GES1、BGC803、BGC823、SGC7901、MKN1、MKN45、N87、AGS胃癌細(xì)胞株均購自于中國科學(xué)院細(xì)胞庫。細(xì)胞均用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至90%融合，進(jìn)行細(xì)胞傳代或用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 蛋白提取

1.3.1 細(xì)胞蛋白提取 將細(xì)胞鋪于6孔板中，培養(yǎng)至90%融合，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗兩遍，在細(xì)胞中加入60μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，用橡皮刮刀將細(xì)胞緩慢刮下。收集所有液體到新的離心管中，冰上放置10 min，裂解細(xì)胞。13 000 g 4℃離心30 min，將上清轉(zhuǎn)到新的離心管中，取上清5μl，選用G250考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行蛋白定量。

1.3.2 組織蛋白提取 用剪刀將組織剪成小塊，冰上操作，快速研磨，根據(jù)組織塊大小加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，使用細(xì)胞超聲破碎儀200 W超聲破碎5次。冰上靜置30 min，13 000 g 4℃離心30 min，將上清轉(zhuǎn)到新的離心管中，取上清5μl，選用G250考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行蛋白定量。

1.4 Western blot鑒定

將蛋白定量后取20μg總蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離，4℃過夜40 V恒壓轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。用MTA1抗體(1∶500稀釋)室溫孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠(1∶5 000稀釋)二抗孵育2 h，然后TBST洗膜3次，每次10 min。ECL顯影。

1.5 共聚焦激光掃描顯微鏡觀察MTA1細(xì)胞內(nèi)定位

將胃癌細(xì)胞鋪于提前放置好蓋片的12孔板中，24 h后用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%TritonX100通透細(xì)胞膜15 min，山羊血清封閉1 h，anti-MTA1抗體(1∶50稀釋)室溫孵育 1 h，PBS洗 3次，每次10 min，Alexa Fluor 488(1∶100 稀釋)，室溫孵育 1 h，PBS洗3次，每次10 min，DAPI(1∶1 000 稀釋)，室溫孵育20 min，PBS洗3次，每次10 min，使用50%甘油封片。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，綠色區(qū)域?yàn)镸TA1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，藍(lán)色代表細(xì)胞核。

2 結(jié) 果

2.1 Western blot檢測胃癌細(xì)胞系中MTA1蛋白表達(dá)的情況

將8種胃癌細(xì)胞鋪于6孔板中，24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，Western blot檢測蛋白表達(dá)(圖1)，MTA1蛋白分子質(zhì)量為82 kDa，GAPDH作為內(nèi)參，分子質(zhì)量為36 kDa。在8種胃癌細(xì)胞株中，有6種胃癌細(xì)胞表達(dá)MTA1。

圖1 Western blot檢測胃癌細(xì)胞系中MTA1蛋白表達(dá)的情況Fig 1 The expressions of MTA1 were detected by Western blot in the gastric cancer cell lines

2.2 MTA1在胃癌細(xì)胞內(nèi)的定位

通過共聚焦激光掃描顯微鏡觀察MTA1在SGC7901細(xì)胞(圖2)和 BGC823細(xì)胞(圖3)內(nèi)的定位，激發(fā)光分別為488 nm(綠色)和340 nm(藍(lán)色)。

2.3 胃癌組織中MTA1蛋白表達(dá)的情況

提取組織蛋白，取20μg總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，Western blot檢測蛋白表達(dá)(圖4)，MTA1蛋白分子質(zhì)量為82 kDa，GAPDH作為內(nèi)參，分子質(zhì)量為36 kDa，N代表癌旁正常組織，T代表腫瘤組織。11例胃癌標(biāo)本中有7例高表達(dá)MTA1，高表達(dá)MTA1比例為63.6%。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MTA1在SGC7901細(xì)胞內(nèi)的定位Fig 2 Confocal microscopy pictures of SGC7901cells show the subcellular localization of MTA1

圖3 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察MTA1在BGC823細(xì)胞內(nèi)的定位Fig 3 Confocal microscopy pictures of BGC823 cells show the subcellular localization of MTA1

圖4 Western blot檢測胃癌組織中MTA1蛋白表達(dá)的情況Fig 4 The expressions of MTA1 were detected by Western blot in the gastric cancer tissues

3 討 論

MTA1是1993年P(guān)encil等［11］應(yīng)用差異雜交從具有轉(zhuǎn)移潛能的鼠乳腺癌細(xì)胞株13762NF中篩選得到的基因。因該基因的表達(dá)與乳腺腫瘤轉(zhuǎn)移能力正相關(guān)，故命名為MTA1。人MTA1編碼715個(gè)氨基酸，分子量為82 kDa。MTA1蛋白羧基末端富含脯氨酸，其696～705氨基酸殘基序列為LPPRPPPPAP，與SH3結(jié)合域 XPXXPPPFXP 或 XpFPpXP 完全配對(duì)［12］，為MTA1與信號(hào)分子相互作用提供生物化學(xué)的基礎(chǔ)［13］。

MTA1包含兩個(gè)二連的核定位信號(hào)和一個(gè)富含堿性氨基酸的核定位信號(hào)［13］。一般而言，MTA蛋白包含堿性的核定位信號(hào)，主要定位在細(xì)胞核中。通過對(duì)小鼠組織的分析，MTA1蛋白存在于多種器官中，包括肺、肝、腎、睪丸，MTA1蛋白的水平是變化的，但是容易檢測到，并且提示MTA1在正常的細(xì)胞中執(zhí)行著生理功能［9］。同樣，MTA1免疫組織化學(xué)的分析證明了在不同的癌組織中MTA1主要定位在核，包括卵巢癌、肺癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌［13］。但是在肝癌細(xì)胞和B細(xì)胞淋巴瘤中，MTA1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有定位［14］。本研究在8種胃癌細(xì)胞中探測MTA1的表達(dá)情況，結(jié)果顯示只有GES1和MKN45兩種細(xì)胞不表達(dá)MTA1。繼而選擇表達(dá)MTA1，并且形態(tài)較好適合作免疫熒光實(shí)驗(yàn)的SGC7901和BGC823兩種細(xì)胞，觀察MTA1的定位情況，發(fā)現(xiàn)在這兩種細(xì)胞中MTA1主要定位在細(xì)胞核中。

轉(zhuǎn)移是癌癥患者發(fā)病和致死的主要原因，在以細(xì)胞為基礎(chǔ)的模型和小鼠模型已經(jīng)確切地證實(shí)了MTA1在癌癥轉(zhuǎn)移中的重要作用［13］。例如在小鼠乳腺上皮組織中MTA1過表達(dá)，能夠?qū)е氯橄侔┑陌l(fā)生［15］。除了乳腺癌以外，子宮內(nèi)膜癌微點(diǎn)陣分析，包含70例不同分級(jí)的子宮內(nèi)膜腺癌，其中53例(75.7%)MTA1表達(dá)增加［7］。在胃癌的研究中，34例胃癌患者13例(38.2%)MTA1 mRNA高表達(dá)。這些發(fā)現(xiàn)提示，漿膜侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與MTA1高表達(dá)密切相關(guān)，并且更容易發(fā)生血管侵襲，侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)行為［16］。不同的實(shí)驗(yàn)室和實(shí)驗(yàn)方法已經(jīng)證明了MTA1與許多癌癥的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，在結(jié)腸癌患者中MTA1與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，MTA1表達(dá)水平與某些惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、血管生成、轉(zhuǎn)移、侵襲能力及預(yù)后密切相關(guān)［17］。在關(guān)于癌癥進(jìn)展的研究中，MTA1已經(jīng)成為非常重要的分子之一［3］。本研究中11例胃癌臨床標(biāo)本中檢測發(fā)現(xiàn)有7例存在MTA1高表達(dá)，胃癌組織與癌旁正常組織相比，MTA1表達(dá)升高，比例達(dá)到63.6%。綜上所述，我們認(rèn)為MTA1將成為癌癥治療的重要靶點(diǎn)。

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